что стало причиной развода Таты и Валеры Блюменкранц
Разрыв экс-участников «ДОМа−2» поверг в шок их поклонников. Dom2Life.ru решил выяснить, что послужило истинным поводом распада семьи Таты и Валеры Блюменкранц.
Валера и Тата Блюменкранц
Фото: Анастасия Адуванчик
Историю любви Таты и Валеры Блюменкранц нельзя назвать идеальной и сказочной. Несмотря на красивые ухаживания в начале их отношений, будущие супруги часто скандалили, ругались и даже расставались. Практически каждый месяц пара обвиняла друг друга во лжи и ставила точки в романе, но через некоторое время вновь сходилась. Сплотить Тату и Валеру смогла только беременность девушки.
25 апреля 2017 года влюбленные сыграли свадьбу, потому что приняли твердое решение рожать ребенка. А в День семьи, любви и верности, 8 июля, на свет появилась малышка Беатриса, которую родители тут же прозвали Бубачкой.
Влюбленные поженились в 2017 году
Фото: «Инстаграм»
Однако ребенок, увы, не смог скрепить узы брака, и уже через год после торжественного бракосочетания Тата готовит документы на развод с Валерой. «Я не пропаду», — прокомментировала для Dom2Life.ru экс-участница «ДОМа−2» размолвку с мужем.
Валера же, в свою очередь, отказался объяснять причину развода с Татой. Он объяснил, что единственное, что его сейчас волнует — это невозможность видеться с Бетти, поскольку жена запрещает ему брать ребенка. Тата Блюменкранц запрещает мужу видеться с дочерью
Dom2Life.ru решил выяснить, что же на самом деле послужило поводом для развода, ведь в их семье было несколько весомых предпосылок к этому.
Рождение ребенка не помогло сплотить семью
Фото: «Инстаграм»
ПЬЯНСТВО
О том, что Валера Блюменкранц любит пригубить, стало известно еще на «ДОМе−2».
Часто мужчина уходил на тусовки с друзьями, а возвращался под утро в изрядно подвыпившем состоянии. Сам глава семейства никогда не признавал эту проблему, однако коллеги по телестройке заявляли обратное. Например, Саша Артемова встретила Валеру в одном из общественных заведений. Валера Блюменкранц снова ушел в загул
«За неделю до возвращения на проект я видела Валеру в ресторане…
Он был заметно пьяненьким. Меня это очень удивило — думала, он помогает Тате с ребенком, наверняка ей в первые месяцы нужна поддержка мужа. Я даже сказала молодому отцу, что ему стоит ехать домой, но он лишь отмахнулся. Потом говорил, что едет в караоке, и звал нас с собой, но мы, конечно же, не поехали», — рассказывала Артемова.
Кстати, о пьянках Блюменкранца говорят и близкие друзья их семьи, пожелавшие остаться инкогнито. Они в голос утверждают, что Валера буквально пропивал последние деньги, пока Тата была, например, в отпуске.
Валеру часто видили выпившим
Фото: «Инстаграм»
ЧАСТЫЕ ТУСОВКИ
Любовь Блюменкранца к гулянкам прослеживается хотя бы в том, что даже работал он одно время в караоке, где люди любят выпить и изрядно повеселиться.
Часто Валера «загуливал» до утра, а иногда и вовсе по нескольку дней пропадал на тусовках, пока дома его ждала жена.
Сам Валера убеждал окружающих, что выезды в клуб помогают ему отдохнуть от проблем и с новыми силами строить отношения и жить в принципе.
«У нас в семье случаются конфликты, в жизни это бывает у всех, и выезды помогают мне развеяться. Если бы я не посещал караоке, то морально мне было бы гораздо тяжелее, все-таки я свободолюбивый человек», — говорил Валера весной 2017-го.
Друзья пары советовали Тате подать на развод, но она заверяла, что в отношениях с Валерой у них все в порядке. Возможно, чаша терпения молодой женщины была переполнена, и именно постоянные загулы мужа стали одной из причин для разрыва отношений с ним.
Блюменкранц — любитель частых тусовок и загулов
Фото: «Инстаграм»
ВАЛЕРА — НЕ ГЛАВНЫЙ КОРМИЛЕЦ В СЕМЬЕ
О том, что экс-участник «ДОМа−2» всегда скудно зарабатывал, говорят многие звезды телестройки.
Так, например, Оля Жарикова уверена, что Валера не был добытчиком в семье и вообще не работал, именно поэтому Тата и приняла решение уйти от него. Хотя она сама могла бы помочь любимому супругу и подтолкнуть его к новым свершениям.
«Не знаю, правда это или нет, но я слышала, что проблема в Валере. Говорят, что он не работает, и семье не хватает денег. Но я уверена, что Тата преувеличивает. Она говорит, что не хватает денег на ребенка. Хотя сама ходит исключительно в дорогих вещах, красят ее профессиональные визажисты, у неё сделанные зубы и губы. Странно как-то, не правда? Валера хороший парень, и он достоин большего», — рассказала Жарикова Dom2Life.ru.
Однако о том, что стало истинной причиной развода Таты и Валеры Блюменкранц, пока остается только догадываться. Сами молодые родители предпочитают не объяснять своего решения поставить точку в отношениях.
Супруги разводятся со скандаломФото: «Инстаграм»
Почему Тата Блюменкранц поскандалила с бывшим мужем
Недавно Тата Блюменкранц в очередной раз поскандалила со своим бывшем мужем.
Тата заявила, что причин для конфликта было несколько.
Подпишитесь и читайте «Экспресс газету» в:
Однако праздник закончился скандалом, потому что Тате пришлось выгнать с торжества своего бывшего мужа Валерия Блюменкранца. Мужчина приехал из Санкт-Петербурга в Москву на день рождения дочери, приготовил подарок, но провел с девочкой очень мало времени.
Как рассказал сам Валерий, в конфликте виновата его бывшая жена.
Мужчина отказался помочь Тате отработать рекламу праздничного агентства. Между супругами вспыхнул скандал, и мужчина ушел с праздника.
А вот Тата придерживается другой версии. Спустя некоторое время после торжества она рассказала в своем микроблоге, что Валерий не взял с собой полотенце и плавки, хотя сам праздник был около бассейна, а Тата надеялась, что бывший муж поплавает вместе с Бетти. Также Блюменкранц пришел в жару в плотном черном костюме и был намерен в скором времени после дня рождения уйти на встречу с друзьями. По словам Таты, Валерий и не собирался долго проводить время с дочкой, а был заинтересован как можно скорее уйти. Также девушка подтвердила, что бывший муж отказался помогать ей с рекламой.
Тата Блюменкранц рассказала про встречу с Курбаном Омаровым, а он пообещал расправиться с теми, кто делал видео
Несколько дней назад в Сети появилось видео, на котором экс-участница проекта «Дом-2» Тата Блюменкранц и Курбан Омаров мило обедают в одном из московских ресторанов.
Поэтому каждый из участников этого ролика посмешил оправдаться перед «сидящей на бревне Всея Руси».
На своей странице в Инстаграм Тата пишет:
«Стала любовницей Курбана. Люди, вы серьезно? Последние несколько суток на меня вылилось огромное количество грязи в соц сетях! Вы пишите, что я любовница Курбана и увела его у Ксюши Бородиной. Я молчала, но больше это слушать не хочу и не буду, поэтому отвечу один раз всем сразу!
Кстати, в моих сторис можете найти и подтверждение Курбана.
Да, мы действительно обедали. Меня пригласил продюсер для обсуждения совместного проекта, где я буду ведущей. Наш обед носил исключительно деловой характер! Но кто-то решил, как крыса, исподтишка, что хайпанет на теме сложных отношений супружеской пары. Увы, у них ничего не получилось и не получится: мы с Курбаном давно знакомы и встретились исключительно для обсуждения дел.
А вот лезть в семейные отношения пары — это дно, господа. Люди взрослые и уверена, разберутся без вас. Надеюсь, теперь все спокойны?».
Курбан тоже выступил с заявлением, пригрозив расправиться с теми «мышами», которые снимают такие видео:
«Наш креативный продюсер позвал меня на встречу для обсуждения нового проекта, где ведущей будет Тата Блюменкранц. Пока мы занимались своими делами, девушка, сидящая с парнем сзади, занималась моими. Она, как мышь, втихаря снимала меня на телефон, чтобы хоть как-то поучаствовать в моей жизни, чтобы ее скучная жизнь обрела хоть какие-то очертания. Благо в этом заведении есть камеры, и я легко определю этого человека. Я найду того, кто это снимал. Даже придумал шоу, которое называется «Мыши», в его рамках будут находить этих людей, снимать их жизнь и показывать вам. Теперь в заведения со мной будут ходить двое операторов — они снимут тех, кто снимает меня.
Напомним, что вместе с этим Курбан посещает творческие вечера красивых женщин, а Лера Фрост открыто смеётся над бывшем работодателем — Ксенией Бородиной.
Напоминаем, что у нас есть большой фотоархив, в котором размещены фото Ксении Бородиной, когда ведущая «Дом-2» была беременна первой дочкой Марусей…
Также есть фото первой свадьбы Ксении с Юрием Будаговым…
Слив в Сеть интимных фото Бородиной из ванны…
Эротическая фотосессия в нижнем белье…
Тогда Ксения Бородина тусила с Михаилом Терёхиным, который тоже появился в неглиже на этих фото…
Многочисленные фото Ксении Бородиной в купальнике уже с мужем Курбаном Омаровым…
Фотосессия Ксении Бородиной для Playboy в октябре 2011 года…
Ещё более откровенные и забытые фото 2008 года для журнала SIM…
Эро-картинки голой Ксении Бородиной в спальне 2008 года…
Фото Ксении Бородиной в позе «догги-стайл» для Playboy в 2007 году.
..
Первые попытки интимных фото в декабрьском XXL 2005 года…
Тата переживает, что Блюменкранц бросит дочь Беатрис после рождения второго ребенка
Беременность Ани Левченко напугала бывшую жену Валеры.
Фото взято из Instagram: @tatablumТата Блюменкранц уже не первый раз поднимает тему о воспитании отцом маленькой Беатрис. По словам девушки, Валера не так активно принимает участие во взрослении наследницы и практически даже не помогает. В очередной раз экс-участница телепроекта «Дом-2» не смогла сдержать эмоций и вновь решила высказаться на эту тему не только в своем микроблоге, но и экс-возлюбленному в личные сообщения.
«Если у мужчины не хватает времени на своего единственного ребенка, то что будет, когда ребенка будет уже два?», — написала девушка.
Тата переживает, что Блюменкранц бросит дочь Беатрис после рождения второго ребенка, которого он ждет от своей избранницы Анны Левченко. Как высказалась бывшая жена, Валера даже не помог ей устроить малышке праздник 8 июля, именно в день любви, семьи и верности, у Бетти был день рождения.
Однако готовила весь сюрприз для наследницы Тата в одиночестве.
Помимо того, что родной отец решил бросить все заботы по приготовлению торжества на бывшую супругу, так еще и на телефонные звонки решил не отвечать несколько дней, зная о дне рождении Бетти.
Экс-участница очень тревожится за маленькую девочку и хочет, чтобы Блюменкранц принимал активное участие в ее жизни, ведь сейчас Беатрис как никогда нужен папа. Не выдержав подобного поведения Валеры, Тата поставила ему условие: либо он занимается и проявляет себя отцом, либо не появляется «раз в полгода» — судя по словам бывшей жены, Блюменкранц и правда «забил» на наследницу.
Пост Таты Блюменкранц взят из Instagram экс-участницы: @tatablumФото Валеры и Беатрис взято из Instagram: @dom2_newsru
Правда, родитель все же приехал на праздник девочки, поздравил ее и частично помог с организацией торжества. Тата, конечно, все равно беспокоится, ведь в скором времени у него родится ребенок и что же будет тогда, если Блюменкранц уже сейчас не занимается Бетти и видит ее два раза в год.
Тата Блюменкранц – как сейчас выглядит, фото до и после пластики
«Дом-2» признанная «кузница звезд» – из его стен вышли Ольга Бузова, Виктория Боня, Алена Водонаева и еще немало «светских львиц», мелькающих на экранах ТВ. Жанр реалити-шоу обязывает участников быть яркими. Лучший способ привлечь к себе внимание – устроить скандал или изменить внешность. Тата Блюменкранц не стала нарушать традицию и сделала пластику. Справедливости ради отметим, что чувство меры девушке не изменило, и она не подвергла лицо радикальным переменам.
«Сахарные уста» Таты Блюменкранц
У настоящей дивы зубы должны быть белоснежные, а губы пухлые. Так, вероятно, рассуждала звезда телестройки, когда решилась на увеличение губ и отбеливание зубов. Как именно Тата увеличила губы, была ли это хейлопластика, то есть полноценная хирургическая операция (например, Булхорн, YV-пластика), или же дело обошлось контурной пластикой гиалуроновыми филлерами, девушка не объясняет, но сам факт обращения к специалистам эстетической медицины не отрицает.
При этом признается, что увеличить губы ей хотелось еще до прихода в проект, но сделать коррекцию мешал страх, который девушка, вдохновленная растущим рейтингом, благополучно преодолела. Что касается зубов, Тата Блюменкранц, по мнению поклонников, явно переборщила с отбеливанием.
Тата Блюменкранц сделала ринопластику?
Хотя девушка и гордится своими грузинскими корнями (ее девичья фамилия – Зухбая), но решила исправить то единственное, что выдавало в ее лице принадлежность к гордому кавказскому народу – нос. Нельзя сказать, что орган дыхания был слишком велик, скорее, широкие ноздри придавали ему фактурность, однако наша героиня решила их сузить. Поскольку, используя косметологические методики, добиться нужного эффекта невозможно, пришлось сделать пластическую операцию, называемую ринопластикой, в ходе которой хирург убрал часть хрящевой ткани. В результате носик стал изящным, что видно при сравнении фото Таты Блюменкранц до и после пластики, хотя девушка факт хирургического вмешательства не подтверждает.
Скулы у Таты стали рельефней! В чем причина?
Сравнивая фото Таты Блюменкранц до проекта и датируемые 2019 годом, заметно, что скулы у девушки действительно выглядят выразительней, хотя и «плоскими» они никогда не были. Такого эффекта (временного, сохраняющегося около 6 месяцев) позволяет добиться контурная пластика, то есть увеличение объема в области скуловых костей посредством введения препаратов, содержащих гиалуроновую кислоту. Второй вариант совсем простой – это грамотное нанесение румян правильного тона, видимо, именно его использует участница проекта. Во всяком случае, «тяжелую артиллерию» в виде хирургического удаления комков Биша (жировой ткани щек) можно однозначно исключить.
Что случилось с глазами Таты Блюменкранц
Поклонники, изучая фото нашей героини, обнаружили, что у нее косоглазие, причем, скорее всего, приобретенное. Если раньше всех интересовал только цвет глаз Таты Блюменкранц (ее радужка имеет довольно экзотический «болотный» оттенок), то теперь ломают голову, то ли девушка не умеет носить линзы, то ли злоупотребляет декоративной косметикой (в частности наращиванием ресниц), то ли с глазами действительно беда.
Одно можно сказать точно – следов блефаропластики (операции по подтяжке кожи век) нет, так что не пластика является причиной косоглазия Таты Блюменкранц!
Как изменилась фигура Таты Блюменкранц
До проекта девушка не имела никаких проблем с фигурой – она отлично сложена и не имела лишнего веса. Во время беременности Тата, естественно, поправилась, но, благополучно разрешившись от бремени, быстро вернула себе былую стать. Как похудела Тата Блюменкранц доподлинно не известно, но очевидно, что ничего радикального типа липосакции она не делала, ограничилась диетой и фитнесом.
Возраст, рост, вес и объемы фигуры Таты Блюменкранц. Реальные и предполагаемые пластические операции
|
Настоящее имя |
Тата Блюменкранц (Абрамсон, Зухбая) |
|
Дата рождения / место рождения |
Родилась Тата 27 февраля 1993 года / Грузия |
|
Род деятельности |
Участница проекта «Дом-2» |
|
Рост Таты Блюменкранц /вес |
169 см / 60 кг |
|
Подтвержденные пластические операции |
Нет |
|
Предполагаемые пластические операции Таты Блюменкранц |
Ринопластика, контурная пластика губ |
На заметку: какие операции планирует сделать Тата Блюменкранц
Интересно, что в последнее время девушка обратила внимание на несовершенство собственных ушей и собирается их немного подкорректировать.
Кроме того, она, по ее словам, созрела до маммопластики, так что не исключено, что в скором будущем мы увидим новую грудь Таты Блюменкранц!
Это интересно: детские фото Таты Блюменкранц
Тата Блюменкранц в Инстаграм. Официальный сайт
[elfsight_instagram_feed id=»339″]
Профиль в Instagram — @_tatia_tatia_
Тата Блюменкранц в Инстаграм активно ведет свою страничку и поддерживает теплые отношения с поклонниками. Жизнь на проекте и рождение ребенка очень сильно изменили мировоззрение и характер девушки. Она каждый день выкладывает свежие фото и пишет к ним полезные посты, вовлекая в свою жизнь все больше подписчиков.
Инстаграм Таты Блюменкранц
День рождения Таты выпал на конец зимы, а именно 27 февраля 1993 года. Мама девочки всегда хотела быть независимой и дать своим детям как можно больше, поэтому она решилась уехать вместе с ними в Китай. Школьное и специальное (экономическое) образование девушка получала уже именно там.
Кроме этого ей удалось в совершенстве овладеть пятью языками, такими как грузинский, английский, китайский, мегрельский и французский.
С 2005 по 2015 год бизнес ее мамы процветал и приносил неплохие доходы, но в начале 2016 года по определенным обстоятельствам он прекратил свое существование. После этого Тата решила поехать в столицу, где и пришла в качестве участницы на популярное телешоу «Дом-2». За счет своей красивой грузинской внешности девушка сразу же понравилась большинству парней.
Целью девушки был Федор Стрелков, так как девушке нравились именно такие мужчины с красивым и спортивным телосложением. Но Стрелков не решился на ухаживания из-за неудачной шутки в его сторону от Таты, на лобном в день прихода. Следующим проектным мужчиной был Семен Фролов, но было очевидно, что девушка им только воспользовалась, так как после голосования пара рассталась. Участники сразу поняли, что девушка, таким образом, хотела прикрыть себя, чтобы не быть номинированной на вылет.
После девушка все-таки нашла свою любовь, им оказался Валерий Блюменкранц, он же сейчас является ее мужем. На телепроекте пара часто ругались, но потом все же мерились. Их свадьба состоялась 26 апреля 2017 года, девушка уже была в положении. На сегодняшний день они воспитывают прекрасную дочурку по имени Беатрис.
Инстаграмм Таты (_tatia_tatia_) наполнен нежностью и материнством. Она часто выкладывает новые фото с участием своей малышки. По свежим данным, которые опубликовал в социальных сетях Валера, пара находится в процессе развода. Единственное что оттягивает процесс по это разные гражданства супругов. Причина их расставания никому не известна, и комментировать данное событие они не желают.
Последние новости
Пару дней назад появилась новость о том, что пара собирается вернуться в телешоу для того, чтобы побороться за главный приз на конкурсе «Человек года». Естественно с разводом им придется повременить.
Роль в обществе и медийность
Девушка является медийной личностью, ее часто приглашают на съемки в различные журналы в качестве модели.
Также Тата Блюменкранц в Инстаграм активно ведет блог, который на сегодняшний день насчитывает более 600 тысяч активных подписчиков.
Ссылка на официальный Инстаграмм
Тата Блюменкранц Инстаграм официальный сайт: https://www.instagram.com/_tatia_tatia
Тата Блюменкранц в Instagram
Тата Блюменкранц (Абрамсон) — Дом 2, личная жизни, биография, инстаграм, вк, фото
Имя участника: Тата Блюменкранц (Абрамсон)
Возраст (день рождения): 27.02.1993
Город: Пекин, Москва
Семья: замужем за Валерием Блюменкранцем, есть ребенок
Тата Блюменкранц (Абрамсон) в социальных сетях:
Вконтакте: vk.com/id326217443
Инстаграм: https://www.instagram.com/_tatia_tatia_/?hl=ru
Тата Абрамсон появилась на свет 27 февраля 1993 года. Смесь грузинской и еврейской крови сделала её неотразимой красавицей. 2005 год стал для девушки переломным, ведь она с родителями переезжает в Китай, где в будущем окончит школу и поступит в университет.
Знает 5 языков, в том числе и китайский. До участия на телепроекте «Дом 2», она проходила пробы в телесериалы и снималась в рекламе.
В марте 2016 года, Тата приходит в «Дом 2» и завоёвывает сердца мужчин своей редкой красотой. Но по итогам голосования, она должна была покинуть проект, и лишь уговоры некоторых участников, оставить Тату на проекте, дали ей еще один шанс. Девушка, будучи на лобном месте заявила, что питает симпатию к одному из участников проекта Фёдору Стрелкову.
Ей понравилась его внешность, спортивное телосложение выделяло Федю среди других парней. Парень же оказался без чувства юмора, и после нелепой шутки со стороны своей девушки, он перестаёт с ней общаться. На реалити-шоу прибыл бывший парень Таты, но вскоре она дала ему понять, что между ними всё кончено навсегда и заново строить отношения они не будут. Парень всё понял и переключился на общение с другой участницей проекта Татьяной Кузнецовой.
Данного шага со стороны бывшего, девушка не вынесла и решилась на крайние меры, она проколола шины мотоцикла, который принадлежит её бывшему бойфренду.
Тем самым давая понять, что с ней шутки плохи и лучше её не злить.
Дальше Тата присмотрела себе нового парня Семена Фролова, но отношения не вышли, так как парень её буквально отпугнул своим странным поведением.
В это время на проект возвращается Валерий Блюменкранц, предварительно написав Абрамсон сообщение о своих любовных намерениях. Сначала они общались просто как друзья, но вскоре заявили, что они пара и им дали заселится в одну из комнат телепроекта. Всё вышло не так гладко в новых отношениях Таты, у Валерия оказался очень сложный и вспыльчивый характер, а из-за этого происходили постоянные ссоры.
Важный момент в жизни Таты наступил тогда, когда она решилась на пластику лица. Она боялась это делать, но переборов страх,отправилась в клинику.
Пластическая операция была проведена на губах девушки, увеличив их объём, тем самым создав новую тему для обсуждения на проекте и среди её фанатов. Кому-то из телезрителей понравился её новый образ, кто-то грубо критиковал вид Таты, оскорбляя её за новую внешность.
Дальше она захотела перекраситься из блондинки в шатенку.
Но особой реакции ни у кого не было. Её парень Валерий в свою очередь, подметил что новая внешность девушки очень скучная. Затем Тата перешла в свой старый образ, вернув себе звание блондинки.
В октябре Тата и Валерий заявили, что у них будет ребенок. Пара через пару месяцев поженилась.
В июле 2017 года, родилась девочка.
Осенью пара вернулась с отпуска на проект Дом 2, их образ кардинально изменился. Теперь пара очень рассудительна и они с радостью раздают советы всем участникам проекта.
Васкулотропиновый рецептор 2 — обзор
VEGFR-2 (KDR у людей или FLK-1 у мышей)
VEGFR-2 связывает VEGF с более низким сродством по сравнению с VEGFR-1, но считается основным медиатором митогенного , ангиогенный и повышающий проницаемость эффекты VEGF. Сайт связывания VEGF на VEGFR-2 был сопоставлен со вторым и третьим IgG-подобными доменами, и он подвергается димеризации и сильному лигандозависимому фосфорилированию тирозина, что приводит к митогенному хемотактическому сигналу и сигналу про выживания.
По-видимому, он имеет по крайней мере два отдельных сайта фосфорилирования тирозина. Считается, что VEGFR-2 имеет решающее значение как фактор выживания при апоптозе, происходящем в его отсутствие (рис. 65-8).
В дополнение к VEGFR-1 и -2, в опухолях и эндотелиальных клетках, по-видимому, есть несколько других рецепторов, которые связывают VEGF, в основном нейропилин (NRP1 и NRP2). Точная функция этих сайтов связывания неизвестна, но они могут индуцировать нейрональное управление и, как полагают, специфичны для VEGF 165, но не для VEGF 121.NRP1 может также представлять VEGF 165 VEGFR-2 таким образом, что он увеличивает эффективность сигнала, опосредованного VEGFR-2. NRP2 может быть связан с развитием лимфатических сосудов. 69
Существует большое количество доказательств, подтверждающих критическую и, вероятно, ограничивающую скорость роль VEGF в неоваскулярных формах возрастной дегенерации желтого пятна. Высокие уровни информационной РНК и повышенные уровни рецепторов VEGF наблюдаются в областях хориоидальной неоваскуляризации у приматов, а также в извлеченных неоваскулярных мембранах пациентов, удаленных во время операции и после аутопсии.
2, 54 Кроме того, есть веские основания полагать, что повышенные уровни VEGF являются непосредственной причиной повышенной проницаемости, наблюдаемой не только при диабетическом макулярном отеке, но и у пациентов с подсенсорной и интраретинальной жидкостью, связанной с хориоидальной неоваскуляризацией. Считается, что изменения проницаемости в результате VEGFR-2 в значительной степени опосредуются эндотелиальной генерацией на основе синтетазы оксида азота повышенных уровней оксида азота и связанными с этим изменениями в потоке кальция (рис.65-8). Эти изменения могут быть отменены либо прямой блокадой VEGF, рецептора, либо NOS с использованием модели нокаута. 2, 70, 71 Инактивация растворимого VEGF моноклональными антителами, направленными против него, или ингибирование ICAM также оказались эффективными. Помимо непрямого ингибирования эффектов VEGF посредством модуляции ICAM или косвенного воздействия на фосфорилазу оксида азота, синтетазу оксида азота или протеинкиназу C, другой модулятор проницаемости, существует несколько других методов, с помощью которых эффекты VEGF могут быть заблокированы в глаз и в другом месте.
Они включают использование класса соединений, называемых аптамерами, которые представляют собой химически синтезированные одноцепочечные нуклеиновые кислоты, либо РНК, либо ДНК, которые связываются с молекулами-мишенями с высокой селективностью и сродством, оставляя нетронутыми ненаправленные функции белка 75, 76 (см. последующий раздел).
Другие методы прямого ингибирования VEGF включают ингибирование его рецепторов тирозинкиназы (VEGFR-1 и -2) либо системным введением, либо переносом гена. Несколько лабораторий описали использование малых интерферирующих РНК (миРНК) для эффективного подавления регуляции генов 77 (см. Следующий раздел).
Хотя все вышеперечисленные ингибиторы VEGF объединяет попытка смягчить пролиферативные эффекты и эффекты проницаемости VEGF на нормальную и неоваскулярную ткань, вероятно, будут различия как в эффективности, так и в безопасности, связанные с выбором агентов по нескольким причинам. Остается неясным и является предметом некоторых дискуссий относительно относительной желательности и безопасности полной блокады всех основных изоформ VEGF по сравнению с исключительно VEGF 165.
В настоящее время нет окончательных данных, позволяющих предположить превосходство одного по сравнению с другим, хотя при наличии полных данных фазы 3 испытаний как пегаптаниба натрия, который сейчас завершен, так и Rhufab, который все еще находится в стадии разработки на момент написания, должна быть достигнута некоторая ясность, даже если будет сделан вывод о том, что эти два действия связывают растворимый VEGF во внеклеточном пространстве и сопоставимы.С теоретической точки зрения, поскольку VEGF 165 является основной изоформой, участвующей в патологической неоваскуляризации, утверждалось, что оставление трех других основных изоформ нетронутыми (121, которая в основном диффундирует в растворимой форме, и 189 и 206, которые в основном связаны с матриксом через высокоаффинные сайты связывания гепарина), позволяет избежать возможности вмешательства в нормальные гомеостатические механизмы, связанные с конститутивной экспрессией VEGF. Имеются некоторые экспериментальные данные, позволяющие предположить, что блокирование VEGF 164 у мышей (эквивалентное VEGF 165 у человека) так же эффективно, как неселективная блокада VEGF, опосредованная антителами, в предотвращении патологической неоваскуляризации в модели, индуцированной гипоксией, при этом не влияя на нормальные физиологические процессы. развитие сосудистой сети сетчатки. 51, 78 Кроме того, было обнаружено, что VEGF 164 более эффективен в стимуляции экспрессии ICAM в эндотелиальных клетках и индукции хемотаксиса моноцитов за счет взаимодействия с VEGFR-1, чем VEGF 121. С другой стороны, эффекты растворимого 121 а также связанные с матриксом изоформы 189 и 206 VEGF могут оказаться важными для пациентов, которым может помочь более широкая блокада. Эти результаты должны быть подтверждены клиническими испытаниями на людях, которые в настоящее время проводятся.
Пространственно и временно регулируемая генная терапия NRF2 с использованием промотора Mcp-1 при повреждении ганглиозных клеток сетчатки
Mol Ther Methods Clin Dev.2017 16 июня; 5: 130–141.
, 1 , 2, ∗ , 3 и 1, 2, 3, ∗∗Kosuke Fujita
1 Департамент контроля Retinal Disehokase Высшая школа медицины, Сендай 980-8574, Япония
Кодзи М.
Нишигучи2 Кафедра высшей офтальмологической медицины, Высшая медицинская школа Университета Тохоку, Сендай 980-8574, Япония
Юкихиро Сига
3 Кафедра офтальмологии, Высшая медицинская школа Университета Тохоку, Сендай 980-8574, ЯпонияТору Накадзава
1 Кафедра контроля заболеваний сетчатки, Высшая медицинская школа Университета Тохоку, Сендай 980-8574, Япония
22
Кафедра продвинутой офтальмологии, Высшая школа медицины Университета Тохоку, Сендай 980-8574, Япония3 Кафедра офтальмологии, Тохоку Уни Высшая школа медицины Versity, Сендай 980-8574, Япония
1 Кафедра контроля заболеваний сетчатки, Высшая медицинская школа Университета Тохоку, Сендай 980-8574, Япония
2 Кафедра продвинутой офтальмологической медицины, выпускник Университета Тохоку Медицинский факультет, Сендай 980-8574, Япония
3 Кафедра офтальмологии, Высшая школа медицины Университета Тохоку, Сендай 980-8574, Япония
∗∗ Автор для переписки: Тору Накадзава, Высшая школа медицины Университета Тохоку, Сендай 980-8574, Япония.
pj.ca.ukohot.dem.hpo@urotnПоступила в редакцию 27 декабря 2016 г .; Принято, 2017 г. 12 апреля.
Это статья в открытом доступе под лицензией CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Эта статья цитируется в других статьях в PMC.- Дополнительные материалы
Документ S1. Рисунки S1 и S2
GUID: 24C15A23-BD26-4282-A039-AEE66BD0ED50
Документ S2. Статья плюс дополнительная информация
GUID: 70B4ACD0-D13E-4185-8877-2F615242DA13
Abstract
Считается, что дегенерация ганглиозных клеток сетчатки, вызванная повреждением аксонов, лежит в основе многих глазных заболеваний, включая глаукому и неврит зрительного нерва.При этих заболеваниях ганглиозные клетки сетчатки поражаются неравномерно, как в пространстве, так и во времени, так что здоровые и нездоровые клетки сосуществуют по разным образцам в разные моменты времени. Здесь мы описываем регулируемую во времени и пространстве генную терапию аденоассоциированного вируса, направленную на уменьшение нежелательных нецелевых эффектов на здоровые нейроны сетчатки. Промотор Mcp-1, который, как ранее было показано, активируется в стрессированных ганглиозных клетках сетчатки после повреждения зрительного нерва мыши, был объединен с нейропротекторным внутриклеточным фактором транскрипции Nrf2 .В этой модели управляемая промотором Mcp-1 экспрессия NRF2, нацеленная только на стрессированные ганглиозные клетки сетчатки, продемонстрировала эффективность, эквивалентную неселективной терапии, управляемой промотором цитомегаловируса, для предотвращения гибели клеток. Однако опосредованная промотором цитомегаловируса транскрипция NRF2 индуцировала клеточные стрессовые реакции и гибель Brn3A-положительных неповрежденных ганглиозных клеток сетчатки. Такие нежелательные эффекты были существенно уменьшены за счет использования промотора Mcp-1. Комбинация чувствительного к стрессу промотора и внутриклеточного терапевтического гена является универсальным подходом для целенаправленного воздействия на клетки с риском дегенерации.Эта стратегия может быть применима к многочисленным хроническим глазным и неглазным состояниям.
Ключевые слова: генная терапия AAV, Mcp-1, NRF2, окислительный стресс, глаукома, оптическая нейропатия, сетчатка
Введение
Глаукома, характеризующаяся прогрессирующей потерей ганглиозных клеток сетчатки (RGC), является одной из ведущих причин слепоты во всем мире. Это многофакторное заболевание, хотя повышенное внутриглазное давление (ВГД) остается единственной доказанной терапевтической целью. При глаукоме и многих других состояниях глаза гибель RGC может происходить неравномерно по сетчатке, так что клетки, подвергшиеся стрессу, и здоровые клетки располагаются рядом друг с другом по схеме, изменяющейся с течением времени.1 Окислительный стресс является важным фактором патогенеза глаукомы. Большой объем доказательств анализа биологических образцов пациентов2, 3, 4, 5 и моделей на животных установил сильную связь между глаукомой и повышенными маркерами окислительного стресса, которые зависят от ВГД 6,7 и не зависят от ВГД 8,9
Адено Генная терапия -ассоциированным вирусом (AAV), обеспечивающая долгосрочную экспрессию терапевтического гена, является многообещающим подходом к лечению хронических глазных состояний. Во всех опубликованных к настоящему времени испытаниях окулярной генной терапии с опосредованной AAV 10, 11, 12, 13, 14 был выбран конститутивно активный промотор, промотор куриного β-актина, чтобы управлять трансгеном с целью максимизации экспрессии, за исключением испытания, в котором использовали промотор RPE65 человека.11 Однако такие промоторы приводят к нерегулируемой экспрессии терапевтического гена во всех AAV-трансдуцированных клетках, включая как поврежденные, так и здоровые клетки, которые могут сосуществовать в одной и той же сетчатке. Это может вызвать стрессовые реакции, вызывая нефизиологические состояния у здоровых. Чтобы обойти эту проблему, использовались тканеспецифичные промоторы для ограничения экспрессии целевого (терапевтического) гена клетками, подверженными риску повреждения.11 Хотя эта стратегия помогает направить экспрессию трансгена на целевой тип клеток, она вполне оправдана. ограниченного использования для условий, в которых здоровые и нездоровые клетки смешиваются в этой популяции.Мы изучили временные профили транскрипции различных промоторов, связанных с путями стресса, и ответных элементов в RGC с использованием репортеров на основе AAV2 в модели раздавливания зрительного нерва у мышей (ONC ).15 В ходе этой работы мы идентифицировали хемоаттрактантный белок 1 моноцитов (Mcp-1). ) промотор, участвующий в рекрутинге лейкоцитов16, как способный управлять экспрессией репортерного гена в стрессированных RGC, предшествующих их гибели с относительно низкой фоновой активностью. Терапевтическая полезность AAV-опосредованной доставки NRF2, фактора транскрипции, индуцирующего экспрессию множества антиоксидантных генов 17, для лечения RGC была продемонстрирована на мышиной модели ONC.18 Однако, поскольку в исследовании использовался промотор конститутивного цитомегаловируса (CMV), связанный с интроном β-глобулина человека для управления экспрессией NRF2, сохранялась озабоченность по поводу нецелевых эффектов на соседние здоровые RGC.
В текущем исследовании мы изучали терапевтическую полезность объединения промотора Mcp-1 с геном фактора транскрипции NRF2 для достижения пространственно и временно скоординированной нейрозащиты на мышиной модели ONC для преодоления потенциальной токсичности конститутивного промотор-опосредованная генная терапия на здоровых RGC.
Результаты
Повышение регуляции транскрипции промотора Mcp-1 Parallels RGC Death
Ранее мы продемонстрировали, что промотор Mcp-1 активируется перед обнаруживаемыми ранними апоптотическими изменениями в мышиной модели ONC и что активация промотора Mcp-1 происходит в основном в RGC. 15 Однако неизвестно, увеличивается ли активность промотора Mcp-1 и возвращается ли к исходному уровню параллельно со смертью RGC. После интравитреальной инъекции основанного на EGFP репортера AAV2, управляемого промотором Mcp-1 (AAV2 / 2.pMcp-1.GFP) (A), Sytox Orange, флуоресцентный маркер гибели клеток, доступный для визуализации in vivo в реальном времени, был использован для оценки временного профиля активации промотора Mcp-1 в отношении гибели RGC после ONC (B) . Мы обнаружили, что усиление активности промотора Mcp-1 предшествовало гибели RGC, вызванной травмой, как сообщалось ранее, 15 и возвращалось к исходному уровню через 20 дней после травмы, параллельно с прекращением гибели RGC. Микроскопическое исследование показало, что некоторые клетки, транскрибирующие Mcp-1-EGFP, также экспрессировали Sytox Orange через 5 дней после травмы, что согласуется с прямой связью Mcp-1-опосредованного стрессового ответа со смертью RGC (C).В аналогичном эксперименте наблюдалась совместная локализация Sytox Orange и EGFP, управляемого промотором CMV, что указывает на то, что промотор CMV также используется в поврежденных клетках (рис. S1).
Временной профиль транскрипционной активности промотора Mcp-1 и гибели RGC после мышиного ONC
(A) Схематическое изображение конструкции AAV2 / 2. Промотор Mcp-1 был разработан для управления экспрессией репортерного гена EGFP (pMcp-1.EGFP). (B) Количественная оценка EGFP-положительных клеток и умирающих клеток, меченных Sytox Orange, каждая в разных группах мышей (N = 8 для каждой группы) до ONC и через 5, 10, 15 и 20 дней после травмы.Изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии in vivo. Ось y показывает количество Sytox-позитивных или EGFP-позитивных клеток по сравнению с количеством клеток той же мыши через 5 дней после ONC, представленное в процентах. Ось x обозначает дни после ONC. (C) Плоское крепление сетчатки, полученное через 1, 5 и 10 дней после ONC, демонстрирующее совместную локализацию EGFP, управляемую промотором Mcp-1 и Sytox Orange после ONC. Совместная локализация Sytox Orange и EGFP не наблюдается на 10-й день. Стрелками обозначены Sytox-позитивные клетки, в которых активирован промотор Mcp-1.Вектор вводили из расчета 2,0 мкл (1,0 × 10 12 гк / мл) на инъекцию. ITR, инвертированный концевой повтор; hGHpA, сигнал полиаденилирования гормона роста человека. EGFP (зеленый), Sytox Orange (красный). Масштабная линейка 20 мкм.
Сверхэкспрессия BDNF или NRF2, управляемая промотором Mcp-1, снижает гибель RGC после мышиных ONC
Затем мы оценили применимость промотора Mcp-1 для эффективной генной терапии после мышиных ONC. Были созданы две конструкции AAV2, несущие либо человеческий BDNF , либо NRF2 , управляемый промотором Mcp-1 (AAV2 / 2.pMcp-1.BDNF и AAV2 / 2.pMcp-1.NRF2) (А). Было показано, что оба гена предотвращают гибель RGC на моделях повреждения сетчатки с использованием конститутивных промоторов.18, 19, 20 Через пять дней после ONC уровни экспрессии обоих трансгенов, управляемых промотором Mcp-1, были повышены на уровне РНК (B) и белка. уровень (С). Более того, гибель клеток сетчатки была снижена на 46,2% за счет экспрессии BDNF (p = 0,0069) и на 62,1% за счет сверхэкспрессии NRF2 (p = 0,00037) (D). Эти данные были подтверждены анализом экспрессии мРНК конститутивных маркеров RGC (Brn3a, Brn3b и Thy1), которые показали более высокие уровни в глазах, обработанных любой конструкцией, по сравнению с необработанными контрольными глазами.Однако этот эффект был более устойчивым у мышей, получавших NRF2, по сравнению с BDNF (E). Это может частично отражать возможную разницу в величине терапевтического эффекта между двумя векторами, обнаруженными с помощью визуализации гибели клеток in vivo (D). Уровни экспрессии всех трех маркеров были выше в глазах, обработанных AAV2 / 2.pMcp-1.NRF2, тогда как экспрессия только Brn3b была повышена после обработки AAV2 / 2.pMcp-1.BDNF.
Терапевтические возможности управляемой промотором Mcp-1 сверхэкспрессии BDNF и NRF2 в мышиных ONC
(A) Схематическое изображение конструкций AAV2 / 2.Конструкция несла BDNF (pMcp-1.BDNF) или NRF2 (pMcp-1.NRF2) в качестве терапевтического гена, управляемого промотором Mcp-1. (B) qRT-PCR анализ уровней экспрессии терапевтических генов через 5 дней после травмы. На графиках показаны относительные уровни экспрессии мРНК в глазах ONC по сравнению с необработанными контрлатеральными глазами (N = 8 на группу). (C) Типичный вестерн-блоттинг с использованием антител против человеческого BDNF (слева) или NRF2 (справа) через 5 дней после ONC. Полоса 66 кДа (стрелка) представляет собой нерасщепленный NRF2, а нижняя полоса (30 т.п.н.) представляет собой его расщепленный фрагмент.β-актин и связывающий белок ТАТА-бокс (ТВР) использовали в качестве внутреннего контроля. (D) Репрезентативные конфокальные изображения гибели клеток in vivo, визуализированные с помощью Sytox Orange через 5 дней после ONC. Верхние панели — это изображения из контрольных глаз, а нижние панели — это изображения из глаз ONC. Количественная оценка Sytox-позитивных RGC на изображениях in vivo (справа; N = 10 на группу). (E) qRT-PCR анализ маркерных генов RGC. На графиках показаны уровни экспрессии мРНК в глазах ONC. Значения выражены относительно необработанного глаза через 7 дней после ONC (N = 8 на группу).Каждый вектор вводили из расчета 2,0 мкл (1,0 × 10 12 гк / мл) на инъекцию для всех экспериментов. Данные представляют собой средние значения ± SEM, * p <0,05. ITR, инвертированный концевой повтор; hGHpA, сигнал полиаденилирования гормона роста человека; Ни Inj, ни инъекции; ND, не обнаруживается; NS, не имеет значения.
Ранняя стресс-реакция, управляемая промотором Mcp-1, и конститутивная CMV-управляемая
Сверхэкспрессия NRF2 имеют сопоставимые терапевтические эффектыСверхэкспрессия секретируемого белка BDNF подмножеством стрессированных RGC может действовать на многие окружающие RGC.В качестве альтернативы сверхэкспрессия NRF2, фактора внутриклеточной транскрипции, может быть ограничена субнабором клеток, инфицированных вектором. Таким образом, NRF2 был выбран в качестве терапевтического гена для изучения потенциала генной терапии с временной и пространственной направленностью с использованием промотора Mcp-1. Чтобы напрямую сравнить терапевтическую эффективность конститутивного промотора (CMV) и раннего стресс-чувствительного промотора Mcp-1, были созданы векторы AAV, экспрессирующие NRF2 под контролем этих промоторов (AAV2 / 2.pCMV.NRF2 и AAV2 / 2.pMcp-1.NRF2) (А). Экспрессия NRF2 , подтвержденная RT-PCR, не различалась до и после ONC в глазах, обработанных AAV2 / 2.pCMV.NRF2 (B). Это отличалось от глаз, обработанных AAV2 / 2.pMcp-1.NRF2, которые показали 31,8-кратное увеличение экспрессии NRF2 после ONC (B). Глаза, обработанные любой из двух конструкций, показали меньшее количество умирающих RGC после повреждения ONC, чем необработанные контрлатеральные контрольные глаза, по оценке интравитреальной инъекции Sytox Orange и визуализации (C).Кроме того, терапевтическая эффективность двух векторов AAV2 была сходной. Однако уровни экспрессии конститутивных маркеров RGC более стабильно повышались с помощью AAV2 / 2.pMcp-1.NRF2 (D). Чтобы проверить функциональную эффективность этих генных методов лечения, после лечения были измерены острота зрения и контрастная чувствительность. Хотя мы не обнаружили влияния лечения на остроту зрения с использованием любого вектора через 1 месяц после ONC, экспрессия NRF2, управляемая промотором Mcp-1 и CMV, улучшила контрастную чувствительность (52,2%, p = 0.003 и 66,7%, p = 0,019, соответственно) без разницы в эффективности (увеличение в процентах) между видами лечения (E). Причина несоответствия терапевтического воздействия на остроту зрения и контрастную чувствительность неясна. Однако улучшение контрастной чувствительности, но не остроты зрения, после лечения не является беспрецедентным.21 Это может отражать умеренный терапевтический эффект на поведение, управляемое зрением.
Сравнение терапевтической эффективности между экспрессией NRF2, управляемой промотором CMV и промотором Mcp-1, в мышином ONC
(A) Схематическое изображение конструкций AAV2 / 2.Каждая конструкция несла NRF2 в качестве терапевтического гена, управляемого промотором CMV (pCMV.NRF2) или промотором Mcp-1 (pMcp-1.NRF2). (B) анализ qRT-PCR экспрессии гена NRF2 человека через 5 дней после травмы. На графиках показаны уровни экспрессии мРНК в глазах ONC по сравнению с контрлатеральными глазами (без ONC) (N = 8 на группу). (C) Типичные изображения гибели клеток, визуализированные Sytox Orange через 5 дней после ONC с использованием конфокальной микроскопии in vivo (левая панель). Верхние панели — это изображения из контрольных глаз, а нижние панели — из глаз ONC.Количественная оценка Sytox-позитивных RGC (правая панель; N = 8 на группу). (D) qRT-PCR анализ маркерных генов RGC. Графики показывают уровни экспрессии мРНК в глазах ONC по сравнению с контралатеральными глазами через 7 дней после ONC (N = 8 на группу). (E) Измерение остроты зрения (левая панель) и контрастной чувствительности (правая панель) через 1 месяц после ONC (N = 6 на группу). Каждый вектор вводили из расчета 2,0 мкл (1,0 × 10 12 гк / мл) на инъекцию для всех экспериментов. Данные представляют собой среднее значение ± SEM, * p <0,05. ITR, инвертированный концевой повтор; hGHpA, сигнал полиаденилирования гормона роста человека; Ни Inj, ни инъекции; NS, не имеет значения.
Конститутивная сверхэкспрессия NRF2 промотором CMV вызывает больший стресс-ответ в здоровых RGC, чем избыточная экспрессия промотором Mcp-1
Мы обнаружили, что сверхэкспрессия NRF2 промотором Mcp-1 приводит к эффективности лечения, аналогичной избыточной экспрессии CMV в модель повреждения аксонов у мышей, оцененная молекулярно, гистологически и поведенчески. Однако ожидается, что промотор Mcp-1 будет минимально транскрибироваться в здоровых клетках, тогда как промотор CMV должен транскрибироваться конститутивно как в поврежденных, так и в здоровых клетках без временной и пространственной специфичности.Это особенно важно для клинического применения, потому что неопределенная сверхэкспрессия целевого гена или генов в здоровых клетках создаст нефизиологическую внутриклеточную среду, которая может привести к потере клеток или нарушению функции. Перед тем, как проверить эту возможность, мы сначала дифференциально измерили экспрессию эндогенного Nrf2 и экзогенного NRF2 . На эндогенную экспрессию Nrf2 не влияла обработка AAV2 / 2.pCMV.NRF2 или AAV2 / 2.pMcp-1.NRF2. Однако мы обнаружили 44,4-кратное увеличение экзогенного NRF2 , сопровождаемое 5,3-кратным увеличением экспрессии Ho-1 , прямой мишени транскрипции NRF2, в здоровых глазах мышей дикого типа, обработанных AAV2 / 2. pCMV.NRF2 по сравнению со здоровыми глазами, обработанными AAV2 / 2.pMcp-1.NRF2 (A). Кроме того, уровни экспрессии маркера стресса эндоплазматического ретикулума Aftf4 и гена пути гибели клеток p53 были повышены только в глазах, обработанных AAV2 / 2.pCMV.NRF2 по сравнению с необработанными глазами и глазами, обработанными AAV2 / 2.pMcp-1.NRF2 (B). Между тем, экспрессия Tgfb1 была повышена в глазах, обработанных любым вектором. Этот результат был подтвержден иммуногистохимией, которая показала повышенную экспрессию Chop, что указывает на активацию стресса эндоплазматического ретикулума, и p53, отражающую активацию пути гибели клеток, в слое ганглиозных клеток (GCL) после обработки AAV2 / 2.pCMV.NRF2 (С). Точно так же уровни экспрессии маркеров стресса Hif1a и Nfkb1 были существенно повышены за счет управляемой промотором CMV экспрессии NRF2, а не за счет управляемой промотором Mcp-1 экспрессии NRF2, в здоровых RGC необработанных глаз.
Нецелевые эффекты экспрессии NRF2, вызванной промотором Mcp-1, по сравнению с промотором CMV в здоровых RGC мышей дикого типа
(A) Анализ qRT-PCR экспрессии гена Ho-1 у обработанных мышей дикого типа или без обработки терапевтическим вектором (AAV2 / 2.pCMV.NRF2 или AAV2 / 2.pMcp-1.NRF2). Ho-1 Экспрессия регулируется NRF2 (N = 8 на группу). (B) qRT-PCR анализ маркерных генов RGC у мышей дикого типа, получавших или не получавших терапевтический вектор. На графиках показаны уровни экспрессии мРНК в сетчатке через 2 месяца после инъекции AAV по сравнению с контрлатеральными необработанными глазами (N = 8 на группу).(C) Репрезентативные изображения иммунореактивности среза сетчатки для Chop (слева) и p53 (справа) через 2 месяца после инъекции AAV. Каждый вектор вводили из расчета 2,0 мкл (1,0 × 10 12 гк / мл) на инъекцию для всех экспериментов. Все данные представляют собой средние значения ± SEM, * p <0,05. GCL, слой ганглиозных клеток; INL, внутренний ядерный слой; Ни Inj, ни инъекции; NS, не имеет значения. Масштабная линейка 50 мкм.
Конститутивная экспрессия NRF2 промотором CMV вызывает стрессовый ответ, который можно уменьшить с помощью промотора MCP-1
Затем мы создали бицистронную конструкцию, в которой промотор Mcp-1 или промотор CMV управляет одновременной экспрессией NRF2 и EGFP для визуального отслеживания экспрессии NRF2 (AAV2 / 2.pMcp-1.NRF2-2A-EGFP и AAV2 / 2.pCMV.NRF2-2A-EGFP) с течением времени в неповрежденных RGC (A). После инъекции этих конструкций в здоровые глаза мышей дикого типа мы периодически контролировали количество трансдуцированных (испускающих EGFP) клеток в течение следующих 8 месяцев с помощью офтальмоскопии in vivo (B и 5C). Как и ожидалось, в отсутствие повреждения аксонов промотор Mcp-1 индуцировал едва заметную экспрессию EGFP, что указывает на низкую фоновую активность промотора, в то время как инъекция промотора CMV приводила к появлению множества EGFP-положительных клеток в неповрежденных глазах.Наиболее важно то, что количество EGFP-положительных клеток постепенно снижалось в течение 1–8 месяцев (снижение ~ 36,3%; тест тенденции Кохрана-Армитиджа, p = 0,025) (B и 5C). Это было в отличие от глаз, обработанных AAV2 / 2.CMV.EGFP, в которых не наблюдалось снижения количества EGFP-положительных клеток в течение того же периода. Результат указывает на то, что сверхэкспрессия NRF2 вызывает дегенерацию RGC. Чтобы различить эти возможности, мы сначала сравнили уровни экспрессии мРНК маркеров RGC Brn3a, Brn3b и Thy1 через 2 месяца после лечения здоровых мышей дикого типа AAV2 / 2.pMcp-1.NRF2 или AAV2 / 2.pCMV.NRF2 (D). Не было различий в уровнях экспрессии Brn3b и Thy1 между двумя группами лечения (E). Однако экспрессия Brn3a снижалась на 20,8% в глазах, обработанных конститутивным промотором (AAV2 / 2.pCMV.NRF2). Мы подтвердили, что это снижение было связано со специфическим снижением BRN3A-положительных RGC с помощью иммуногистохимии и сравнительного количественного определения BRN3A-положительных клеток и DAPI-положительных клеток в срезах сетчатки через 4 месяца (F).
Сравнительная оценка токсичности экспрессии NRF2 под действием промотора CMV или Mcp-1 в здоровых RGC у мышей дикого типа
(A) Схематическое изображение векторов AAV2 / 2, используемых в (B) и (C).Бицистронные конструкции состояли из промотора Mcp-1 (pMcp-1.NRF2-2A-EGFP) или промотора CMV (pCMV.NRF2-2A-EGFP), управляющего NRF2, соединенным с EGFP через саморасщепляющийся пептид (2A). (B) Репрезентативные изображения in vivo экспрессирующих NRF2 EGFP-позитивных клеток (RGC) у мышей дикого типа через 1, 4 и 8 месяцев после инъекции AAV, полученные с помощью конфокальной микроскопии. (C) Количественная оценка NRF2-экспрессирующих EGFP-положительных RGC из изображений in vivo (N = 5 каждый). (D) Схематическое изображение конструкций AAV2 / 2, используемых в (E) и (F).Каждая конструкция несла NRF2 в качестве терапевтического гена, управляемого промотором CMV (pCMV.NRF2) или промотором Mcp-1 (pMcp-1.NRF2). (E) анализ qRT-PCR маркерных генов RGC у мышей дикого типа, получавших или не получавших терапевтический вектор. Графики показывают уровни экспрессии мРНК в сетчатке через 2 месяца после инъекции AAV по сравнению с контрлатеральными необработанными глазами (N = 8 в каждом). (F) Иммуногистохимический анализ срезов сетчатки, окрашенных антителами против Brn3a (зеленый) через 4 месяца после инъекции AAV (слева), с сильно увеличенными изображениями, показанными на вставках.Графики показывают количественную оценку Brn3a-положительных клеток на DAPI-положительные клетки (в центре; N = 6 каждая) и DAPI-положительных клеток (справа; N = 6 каждая) в GCL по изображениям. Каждый вектор вводили из расчета 2,0 мкл (1,0 × 10 12 гк / мл) на инъекцию для всех экспериментов. Все данные представляют собой средние значения ± SEM. * p <0,05 с тестом Кокрана-Армитиджа для определения тенденции. GCL, слой ганглиозных клеток; INL, внутренний ядерный слой; 2А, саморасщепляющийся пептид; ITR, инвертированный концевой повтор; hGHpA, сигнал полиаденилирования гормона роста человека.Масштабная линейка 50 мкм.
Обсуждение
В этом исследовании мы обнаружили, что AAV-опосредованная сверхэкспрессия терапевтического фактора транскрипции NRF2, вызванная ранним стресс-чувствительным промотором Mcp-1, спасала RGC у мышей модели ONC, минимизируя нежелательные эффекты вне мишени на здоровые RGC, связанные с с учредительными промоторами. Использование чувствительного к стрессу промотора обеспечивает существенное преимущество перед конститутивным промотором для генной терапии многих хронических заболеваний, при которых поврежденные и здоровые клетки смешиваются в одной и той же ткани.Следовательно, терапия, управляемая промотором Mcp-1, может быть эффективной при различных глазных и неглазных состояниях.
Обнаружение того, что спасительный эффект AAV2 / 2.pMcp-1.NRF2 после ONC был более устойчивым по сравнению с AAV2 / 2.pCMV.NRF2, было неожиданным. Хотя механизм, с помощью которого возникает такая разница, в значительной степени неизвестен, отрицательные нецелевые эффекты AAV2 / 2.pCMV.NRF2 на RGC, как показано на и, могли внести свой вклад в результат. Сходным образом, причина, по которой сверхэкспрессия NRF2 токсична для клеток, экспрессирующих Brn3a, но не для клеток, экспрессирующих Brn3b, неясна.Факторы транскрипции Brn3a и Brn3b с высоким гомологичным POU-доменом обладают идентичными транскрипционными характеристиками. Однако функциональные роли этих факторов транскрипции в RGC различаются, возможно, из-за типов клеток, в которых экспрессируется белок.22 Известно, что экспрессия p53 сильно ингибирует опосредованную Brn3a экспрессию протоонкогена Bcl-2, который защищает нейрональные клетки. от запрограммированной гибели клеток33 был повышен в глазах со сверхэкспрессией NRF2. Это могло частично способствовать гибели Brn3a-позитивных RGC.
Накапливающиеся клинические данные показывают, что окислительный стресс является ключевым патогенетическим процессом при многих хронических состояниях, поражающих сетчатку, включая возрастную дегенерацию желтого пятна (AMD), 24, 25 диабетическую ретинопатию, 25, 26 пигментный ретинит, 27 и глаукому, 3, 28, которые вместе составляют большинство случаев слепоты в развитых странах. Эти клинические данные хорошо подтверждаются фундаментальными исследованиями на животных моделях этих состояний, которые предоставили доказательства участия окислительного стресса и терапевтического потенциала антиоксидантной терапии.29 Однако эпидемиологические исследования показали, что простой пероральный прием антиоксидантных питательных веществ не лишен системных побочных эффектов. Например, прием витамина Е, антиоксиданта, в дозе, которая, как было доказано, эффективна для предотвращения AMD, было связано с повышенным риском рака простаты.30 Такие доказательства вредных нецелевых эффектов обеспечивают убедительное обоснование для ограничения терапевтического гена или агента. к определенной ткани или подмножеству клеток. Генная терапия, обеспечивающая локальную и долгосрочную экспрессию, может быть особенно привлекательным подходом для лечения хронических неизлечимых заболеваний.Другие продемонстрировали терапевтическую эффективность AAV-опосредованной доставки NRF2 на мышиных моделях пигментного ретинита и ONC.18 Аналогичным образом, концепция управления антиоксидантным гена Nrf2 с помощью раннего индуцируемого стрессом промотора должна быть эффективной для лечения многих других глазных заболеваний. чем глаукома, потому что нецелевая экспрессия трансгенов и связанная с этим долговременная токсичность являются серьезной проблемой для большинства хронических глазных заболеваний. Mcp-1, растворимый хемокин, который можно обнаружить в образцах глазной жидкости пациента, является чувствительным маркером стрессовой реакции глазных клеток при многих хронических состояниях глаза.Повышенные уровни экспрессии белка, отражающие повышенную транскрипцию промотора Mcp-1, были продемонстрированы в образцах глазной жидкости от пациентов с хроническими слепыми заболеваниями глаз, включая AMD, 31, 32 диабетическую ретинопатию, 33 увеита, 34 отслоение сетчатки, 35, 36, 37 и пигментный ретинит.38 Аналогичным образом, повышенное содержание MCP-1 в водянистой влаге было зарегистрировано при глаукоме.39, 40 Хотя клеточный источник этого повышенного MCP-1 остается неопределенным, надежная экспрессия при множественных заболеваниях предполагает, что промотор Mcp-1 использованный в текущем исследовании, может быть широко применим для ранней стресс-чувствительной генной терапии при многих заболеваниях, вызывающих слепоту, включая глаукому.
Использование индуцибельных промоторов, включая индуцируемые лекарственными средствами промоторы, хорошо известно в области глаз.41, 42, 43, 44 Однако успешное применение таких промоторов in vivo на животных моделях глазных заболеваний и нейродегенерации происходит редко. Сообщалось об успешном применении индуцируемого гипоксией промотора in vivo для лечения моделей ишемической ретинопатии.45 Аналогичным образом, сообщалось о полезности в модели окклюзии средней мозговой артерии у мышей.46 В этой модели элемент ответа на гипоксию соединен с Ген BDNF , доставленный в ипсилатеральную хвостатую скорлупу, уменьшал объем инфаркта.
В заключение, управляемая промотором Mcp-1 избыточная экспрессия NRF2 только в подвергнутых стрессу RGCs эффективно предотвращает дегенерацию после повреждения нервов, в то же время существенно снижая нецелевую гибель здоровых соседних RGC. Этот подход универсален и потенциально может быть применен ко многим другим состояниям, в которых окислительный стресс играет центральную патогенную роль.
Материалы и методы
Животные
В этом исследовании использовались взрослые (от 6 до 32 недель) самцы мышей C57BL / 6J (Japan SLC).Животных содержали в цикле 14 часов света и 10 часов темноты со свободным доступом к пище и воде. Хирургические процедуры проводились под глубокой анестезией, вызванной внутрибрюшинным введением смеси кетамина (37,5 мг / кг) и медетомидина (0,625 мг / кг). Эффект медетомидина отменялся внутрибрюшинной инъекцией 1 атипамезола (0,25 мг / кг). Со всеми мышами обращались и содержали в соответствии с руководящими принципами Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) по использованию животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и внутренними руководящими принципами по уходу и использованию животных.Все экспериментальные процедуры проводились после одобрения этическим комитетом экспериментов на животных в Высшей школе медицины Университета Тохоку. Перед количественной оценкой мышей замаскировали, чтобы ограничить субъективную предвзятость. Животных случайным образом распределяли по группам, получавшим или не получавшим AAV, из данного помета мышей. Контралатеральный глаз служил внутренним контролем, которому частично не было показано лечение, поскольку не было различий в ОТ-ПЦР экспрессии маркера RGC между глазами, не получавшими лечения, и глазами, обработанными AAV2 / 2.pCMV.EGFP после ONC (рисунок S2). Оценка размера выборки была рассчитана с помощью калькулятора размера выборки для экспериментов на животных (http://www.lasec.cuhk.edu.hk/sample-size-calculation.html).
Повреждение аксонов
ONC для индукции повреждения аксонов в RGC выполняли, как описано ранее.47 Вкратце, зрительный нерв обнажали, избегая кровеносного сосуда, и раздавливали щипцами примерно на 2 мм кзади от глазного яблока в течение 5 с. Через несколько минут после ONC нормальное кровообращение в сетчатке было подтверждено прямым наблюдением за глазным дном.Затем на обработанный глаз наносили мазь с антибиотиком.
Конструкция AAV
Для конструирования векторов pMcp-1.BDNF и pMcp-1.NRF2 фрагмент мышиного промотора Mcp-1 (560 п.н. непосредственно перед инициирующим кодоном ATG; номер доступа {«type»: «entrez -nucleotide «,» attrs «: {» text «:» U12470 «,» term_id «:» 529692 «,» term_text «:» U12470 «}} U12470) и кДНК BDNF (KIBB9810; Promega) или кДНК NRF2 (KIBB7828; Promega) вставляли в вектор экспрессии без промотора pAAV-MCS (Cell Biolabs).Для конструирования pMcp-1.NRF2-2A-EGFP один и тот же фрагмент промотора Mcp-1, кДНК NRF2, кДНК линкерного пептида 2A и кДНК EGFP (Clontech) были вставлены в вектор экспрессии без промотора pAAV-MCS с использованием Система сборки Гибсона (New England Biolabs). Для конструирования pCMVNRF2-2A-EGFP кДНК Nrf2, пептид 2A и egfp кДНК (Clontech) вставляли в вектор экспрессии pAAV-CMVp-MCS (Cell Biolabs) с использованием системы сборки Гибсона (New England Biolabs). Для pAAV.CMV.EGFP с использованием вектора pAAV-GFP (Cell Biolabs), вирусные векторы AAV2 / 2 были созданы и очищены в соответствии с методом, описанным ранее.48 Каждый вектор (1,0 × 10 12 копий генома [gc] / мл) вводили при 2,0. мкл на инъекцию в стекловидное тело анестезированной мыши. Доза была одинаковой во всех экспериментах с интравитреальным введением AAV в этом исследовании.
In vivo Cellular Imaging
Мечение клеточной смерти проводили с использованием Sytox Orange (Life Technologies), как описано ранее.49 Sytox Orange (2,5 нМ) вводили интравитреально в дозе 1,0 мкл / инъекцию. Изображения получали с помощью конфокальной офтальмоскопии (Nidek F10; Nidek) через 10 минут после инъекции, как описано ранее. Вкратце, мышей анестезировали и зрачки расширяли 2,5% фенилэфрина и 1,0% тропикамида. Синий лазерный свет (488 нм) использовался для возбуждения EGFP, а полосовой фильтр, установленный на 510–550 нм, использовался для захвата излучения. Для возбуждения использовали зеленый лазерный свет (532 нм), а для улавливания излучения Sytox Orange использовали барьерный фильтр с отсечкой 555 нм.Четкого различия между сигналами Sytox Orange и EGFP не удалось. Фокус регулировался на слое RGC в заднем полюсе сразу после поверхности сетчатки. Шесть необработанных изображений были усреднены для получения изображения заднего полюса с выровненной по центру головкой зрительного нерва для анализа. Количество флуоресцентных клеток определяли по одному изображению в заданный момент времени на мышь наблюдателем, не знающим истории лечения.
qRT-PCR
Суммарную РНК экстрагировали из сетчатки с использованием набора miRNeasy Plus Mini (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя.Один микрограмм общей РНК подвергали обратной транскрипции в реакционной смеси объемом 10 мкл с использованием SuperScript III (Thermo Fisher Scientific) и проводили qRT-PCR (7500 Fast Real-Time PCR System; Thermo Fisher Scientific). 20 мкл смеси qRT-PCR содержали 1,0 мкл кДНК, 1,0 мкл зонда TaqMan (Thermo Fisher Scientific) и 1 × TaqMan Fast Universal PCR Master mix (Thermo Fisher Scientific). ПЦР выполняли в 96-луночных планшетах с использованием начальной стадии денатурации 95 ° C в течение 20 с, затем 40 циклов при 95 ° C в течение 3 секунд и 60 ° C в течение 20 секунд.Для относительного сравнения экспрессии генов мы проанализировали данные qRT-PCR, используя сравнительный метод Ct (2-ΔΔCT), нормированный на Gapdh в качестве эндогенного контроля. Использовались следующие зонды TaqMan: Atf4 (Mm00515324; Thermo Fisher Scientific), BDNF (Hs02718934; Thermo Fisher Scientific), Ho-1 (Mm00516005; Thermo Fisher Fisher Scientific), NFC1 Scientific), NRF2 (Hs00975961; Thermo Fisher Scientific), Gapdh (Mm99999915; Thermo Fisher Scientific), Brn3a (Mm02343791; Thermo Fisher Scientific), Brn3b 75; Mm (Mm00493681; Thermo Fisher Scientific), Tgfb1 (Mm00441729; Thermo Fisher Scientific) и p53 (Mm01731290; Thermo Fisher Scientific).
Вестерн-блот
Изолированную сетчатку мыши лизировали в буфере для радиоиммунопреципитации (RIPA) с добавлением ингибитора протеазы (Roche) двумя 30-секундными обработками ультразвуком на льду. Ядерные белки выделяли с использованием набора для ядерной экстракции (Abcam) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию общего белка измеряли с помощью набора для анализа белка Pierce bicinchoninic acid (BCA) (Thermo Fisher Scientific). Белки сетчатки мыши (по 15 мкг каждый) разделяли с помощью SDS-PAGE на 4-15% градиентных гелях (Bio-Rad) и переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) (Millipore).Мембраны блокировали в 5% молочном / фосфатном буферном растворе с твином 20 (PBS-T) в течение 1 часа, а затем инкубировали с антителами против BDNF (AB1513, 1/1000; Millipore), NRF2 (sc-13032, 1/1000; Santa Cruz Biotechnology), β-актин (F5316, 1 / 2,000; Sigma-Aldrich) и TBP (# 8515, 1 / 1,000; Cell Signaling Technology) в течение 1 часа. Иммуномеченные мембраны промывали трижды PBS-T по 10 мин каждый, инкубировали с антителами против кроличьего иммуноглобулина G (IgG), конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) (A0545, 1/2 000; Sigma-Aldrich), в течение 1 часа, а затем промывали четыре раза по 5 мин каждый PBS-T.Иммуногенная реакция была обнаружена ECL Prime (GE Healthcare).
Иммуногистохимия
Глаза фиксировали в 4% параформальдегиде, вводили в состав для оптической когерентной томографии (ОКТ) (Sakura Finetek) и делали срезы с помощью криостата (CM3050; Leica Microsystems). Срез блокировали 5% ослиной сывороткой в течение 30 минут, инкубировали с козьим антителом против Brn3a (sc-31984, 1: 100; Santa Cruz Biotechnology), мышиным антителом против измельчения (# 2895, 1: 500; Cell Signaling Technology. ), или кроличье антитело против p53 (sc-6243, 1: 100; Santa Cruz Biotechnology) в течение 1 часа, а затем окрашивают соответствующим вторичным антителом (против козьего Alexa Fluor 488, против кроличьего Alexa Fluor 488 или анти- мышь Alexa Fluor 488; Thermo Fisher Scientific) и DAPI (Vector Labs) в течение дополнительных 45 мин.Для первичных антител, продуцируемых у мышей, замороженные срезы обрабатывали с использованием набора для иммунодетекции мышей на мышах (BMK-2202, Vector Labs) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки в GCL подсчитывали в области 2 размером 1 мм на каждой стороне зрительного нерва под объективом 20 × в пяти срезах с интервалом 60 мкм от каждой сетчатки.
Optomotry
Острота зрения и контрастная чувствительность были измерены путем наблюдения оптокинетических ответов мышей на вращающиеся синусоидальные решетки (OptoMotry, Cerebral Mechanics) 50, как описано ранее.48 Протокол дает независимые измерения остроты зрения правого и левого глаза на основе неодинаковой чувствительности к направлению вращения паттерна, поскольку движение в направлении от височной к носу преобладает в реакции отслеживания.48 Мышей содержали при стандартных условиях освещения не менее 6 часов. прежде, чем они были помещены в записывающую камеру. Острота зрения и контрастная чувствительность, представленные для каждого глаза, представляют собой средние значения четырех испытаний, проведенных в отдельные дни.
Статистический анализ
Различия между двумя группами оценивали с помощью непарного t-критерия Стьюдента.Значение p <0,05 считалось значимым. Тест Кохрана-Армитиджа (p <0,05) применялся для оценки тенденций к увеличению или уменьшению количества EGFP-положительных клеток в течение 8 месяцев после лечения (C) с использованием R (http://www.R-project.org) . Нормальное распределение оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова с использованием R. Все значения выражены как среднее ± SEM.
Вклад авторов
K.F. и К.М.Н. написал рукопись. К.Ф. выполнил большинство экспериментов. Ю.С. и т.Н. помогал в опытах на животных. К.Ф., К.М.Н., Т.Н. получил финансирование.
Конфликт интересов
У авторов нет конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана JSPS KAKENHI Grants-in-Aid for Scientific Research C (16K11315 to KMN) and for Young Scientists B (16K20301 to KF), Благотворительным трастовым фондом 2016 года для офтальмологических исследований в память Основатель Santen Pharmaceutical (для KMN), Японское национальное общество по профилактике слепоты (для К.M.N.) и фонд Senju Pharma Co. (K.M.N. и T.N.). Мы использовали Enago Co. Ltd. (http://www.enago.jp/) для редактирования и корректуры на английском языке.
Дополнительная информация
Документ S1. Рисунки S1 и S2: Документ S2. Статья плюс дополнительная информация:Ссылки
1. Куигли Х.А., Аддикс Э.М., Грин В.Р. Повреждение зрительного нерва при глаукоме человека. III. Количественная корреляция потери нервных волокон и дефекта поля зрения при глаукоме, ишемической нейропатии, отеке диска зрительного нерва и токсической нейропатии.Arch. Офтальмол. 1982; 100: 135–146. [PubMed] [Google Scholar] 2. Иззотти А., Сакка С.С., Картилья С., Де Флора С. Окислительное повреждение дезоксирибонуклеиновой кислоты в глазах пациентов с глаукомой. Являюсь. J. Med. 2003. 114: 638–646. [PubMed] [Google Scholar] 3. Феррейра С.М., Лернер С.Ф., Брунзини Р., Эвелсон П.А., Ллесуй С.Ф. Маркеры окислительного стресса в водянистой влаге у больных глаукомой. Являюсь. J. Ophthalmol. 2004. 137: 62–69. [PubMed] [Google Scholar] 4. Чанг Д., Ша К., Чжан Х., Лю П., Ронг С., Хань Т., Лю П., Пан Х.Оценка параметров окислительного стресса у пациентов с первичной закрытоугольной глаукомой. PLoS ONE. 2011; 6: e27218. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Химори Н., Куниката Х., Сига Ю., Омодака К., Маруяма К., Такахаши Х., Накадзава Т. Связь между системным оксидативным стрессом и глазным кровотоком у пациентов с глаукомой нормального давления. Graefes Arch. Clin. Exp. Офтальмол. 2016; 254: 333–341. [PubMed] [Google Scholar] 6. Морено М.К., Кампанелли Дж., Санде П., Санес Д.А., Келлер Сармиенто М.И., Розенштейн Р.Э. Окислительный стресс сетчатки, вызванный высоким внутриглазным давлением. Свободный Радич. Биол. Med. 2004. 37: 803–812. [PubMed] [Google Scholar] 7. Тезел Г., Ян X., Цай Дж. Протеомная идентификация окислительно модифицированных белков сетчатки в модели глаукомы на крысах, вызванной хроническим давлением. Инвестировать. Офтальмол. Vis. Sci. 2005; 46: 3177–3187. [PubMed] [Google Scholar] 8. Левкович-Вербин Х., Харрис-Черрути С., Гронер Ю., Уилер Л.А., Шварц М., Йолес Э. Смерть RGC у мышей после повреждения зрительного нерва: окислительный стресс и нейрозащита.Инвестировать. Офтальмол. Vis. Sci. 2000; 41: 4169–4174. [PubMed] [Google Scholar] 9. Химори Н., Ямамото К., Маруяма К., Рю М., Тагучи К., Ямамото М., Накадзава Т. Критическая роль Nrf2 в вызванной окислительным стрессом гибели ганглиозных клеток сетчатки. J. Neurochem. 2013; 127: 669–680. [PubMed] [Google Scholar] 10. Hauswirth WW, Aleman TS, Kaushal S., Cideciyan AV, Schwartz SB, Wang L., Conlon TJ, Boye SL, Flotte TR, Byrne BJ, Jacobson SG Лечение врожденного амавроза Лебера, вызванного мутациями RPE65, путем субретинальной инъекции в глаз адено- вектор гена ассоциированного вируса: краткосрочные результаты исследования фазы I.Гм. Gene Ther. 2008; 19: 979–990. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 11. Бейнбридж Дж. У., Смит А. Дж., Баркер С. С., Робби С., Хендерсон Р., Балагган К., Вишванатан А., Холдер Г. Э., Стокман А., Тайлер Н. Влияние генной терапии на зрительную функцию при врожденном амаврозе Лебера. N. Engl. J. Med. 2008; 358: 2231–2239. [PubMed] [Google Scholar] 12. Магуайр А.М., Симонелли Ф., Пирс Е.А., Пью Е.Н., мл., Мингоцци Ф., Бенничелли Дж., Банфи С., Маршалл К.А., Теста Ф., Сураче Е.М. Безопасность и эффективность переноса генов при врожденном амаврозе Лебера.N. Engl. J. Med. 2008; 358: 2240–2248. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 13. Макларен Р.Э., Гроппе М., Барнард А.Р., Коттриалл С.Л., Толмачева Т., Сеймур Л., Кларк К.Р., Во время М.Дж., Кремерс Ф.П., Блэк Г.С. Генная терапия сетчатки у пациентов с хориидеремией: первые результаты клинического исследования фазы 1/2. Ланцет. 2014; 383: 1129–1137. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Rakoczy E.P., Lai C.M., Magno A.L., Wikstrom M.E., French M.A., Pierce C.M., Schwartz S.D., Blumenkranz M.С., Чалберг Т.В., Дели-Эспости М.А., Констебль И.Дж. Генная терапия рекомбинантными аденоассоциированными векторами для неоваскулярной возрастной дегенерации желтого пятна: наблюдение в течение 1 года после рандомизированного клинического исследования фазы 1. Ланцет. 2015; 386: 2395–2403. [PubMed] [Google Scholar] 15. Fujita K., Nishiguchi K.M., Yokoyama Y., Tomiyama Y., Tsuda S., Yasuda M., Maekawa S., Nakazawa T. Клеточная визуализация in vivo различных путей стресса / реакции с использованием AAV после повреждения аксонов у мышей. Sci. Отчет 2015; 5: 18141. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16.Тони Л. М., Катторетти Г., Граф Дж. А., Мергоуб Т., Пандольфи П. П., Далла-Фавера Р., Йе Б. Х., Дент А. Л. BCL-6 регулирует транскрипцию генов хемокинов в макрофагах. Nat. Иммунол. 2000; 1: 214–220. [PubMed] [Google Scholar] 17. Ито К., Чиба Т., Такахаши С., Исии Т., Игараси К., Катох Ю., Ояке Т., Хаяси Н., Сато К., Хатаяма И. Гетеродимер Nrf2 / small Maf обеспечивает индукцию фазы. II детоксифицирует гены ферментов с помощью элементов антиоксидантного ответа. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 1997. 236: 313–322.[PubMed] [Google Scholar] 18. Xiong W., MacColl Garfinkel A.E., Li Y., Benowitz L.I., Cepko C.L. NRF2 способствует выживанию нейронов при нейродегенерации и остром повреждении нервов. J. Clin. Инвестировать. 2015; 125: 1433–1445. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 19. Ди Поло А., Айгнер Л.Дж., Данн Р.Дж., Брей Г.М., Агуайо А.Дж. Длительная доставка нейротрофического фактора головного мозга инфицированными аденовирусом клетками Мюллера временно спасает поврежденные ганглиозные клетки сетчатки. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 1998; 95: 3978–3983.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20. Ливер С.Г., Цуй К., Плант Г.В., Арулпрагасам А., Хишех С., Верхааген Дж., Харви А.Р. Опосредованная AAV экспрессия CNTF способствует долгосрочному выживанию и регенерации ганглиозных клеток сетчатки взрослых крыс. Gene Ther. 2006; 13: 1328–1341. [PubMed] [Google Scholar] 21. Ву Г.К., Далзил К.С. Пилотное исследование оценки контрастной чувствительности лечения амблиопии с помощью CAM. Acta Ophthalmol. (Копенг.) 1981; 59: 35–37. [PubMed] [Google Scholar] 22. Бадеа Т.К., Кэхилл Х., Ecker J., Hattar S., Nathans J. Различная роль транскрипционных факторов brn3a и brn3b в контроле развития, морфологии и функции ганглиозных клеток сетчатки. Нейрон. 2009. 61: 852–864. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 23. Budhram-Mahadeo V., Morris P.J., Smith M.D., Midgley C.A., Boxer L.M., Latchman D.S. p53 подавляет активацию промотора Bcl-2 транскрипционным фактором семейства Brn-3a POU. J. Biol. Chem. 1999; 274: 15237–15244. [PubMed] [Google Scholar] 24. Группа исследования глазных болезней «случай-контроль» Антиоксидантный статус и неоваскулярная возрастная дегенерация желтого пятна.Arch. Офтальмол. 1993; 111: 104–109. [PubMed] [Google Scholar] 25. Samiec P.S., Drews-Botsch C., Flagg E.W., Kurtz J.C., Sternberg P., Jr., Reed R.L., Jones D.P. Глутатион в плазме человека: снижение в связи со старением, возрастной дегенерацией желтого пятна и диабетом. Свободный Радич. Биол. Med. 1998. 24: 699–704. [PubMed] [Google Scholar] 26. Хартнетт М.Э., Страттон Р.Д., Браун Р.В., Рознер Б.А., Лэнхэм Р.Дж., Армстронг Д. Сывороточные маркеры окислительного стресса и тяжесть диабетической ретинопатии. Уход за диабетом.2000; 23: 234–240. [PubMed] [Google Scholar] 27. Мартинес-Фернандес де ла Камара К., Салом Д., Секедо, доктор медицины, Эрвас Д., Марин-Ламбис К., Аллер Э., Хайхо Т., Диас-Ллопис М., Миллан Дж. М., Родриго Р. Измененный антиоксидант-окислитель состояние водянистой влаги и периферической крови пациентов с пигментным ретинитом. PLoS ONE. 2013; 8: e74223. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 28. Saccà S.C., Pascotto A., Camicione P., Capris P., Izzotti A. Окислительное повреждение ДНК в трабекулярной сети человека: клиническая корреляция у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой.Arch. Офтальмол. 2005; 123: 458–463. [PubMed] [Google Scholar] 29. Рон М., Басу А. Фитохимические вещества и возрастные глазные болезни. Nutr. Ред. 2008; 66: 465–472. [PubMed] [Google Scholar] 30. Klein EA, Thompson IM, Jr., Tangen CM, Crowley JJ, Lucia MS, Goodman PJ, Minasian LM, Ford LG, Parnes HL, Gaziano JM Витамин E и риск рака простаты: испытание по профилактике рака селеном и витамином E ( ВЫБРАТЬ) ДЖАМА. 2011; 306: 1549–1556. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 31. Йонас Дж.Б., Тао Ю., Ноймайер М., Финдейзен П. Белок-хемоаттрактант моноцитов 1, молекула межклеточной адгезии 1 и молекула адгезии сосудистых клеток 1 при экссудативной возрастной дегенерации желтого пятна. Arch. Офтальмол. 2010; 128: 1281–1286. [PubMed] [Google Scholar] 32. Jonas J.B., Tao Y., Neumaier M., Findeisen P. Концентрация цитокинов в водянистой влаге глаза с экссудативной возрастной дегенерацией желтого пятна. Acta Ophthalmol. 2012; 90: e381 – e388. [PubMed] [Google Scholar] 33. Эльнер С.Г., Эльнер В.М., Яффе Г.Дж., Стюарт А., Кункель С.Л., Стритер Р.М. Цитокины при пролиферативной диабетической ретинопатии и пролиферативной витреоретинопатии. Curr. Eye Res. 1995; 14: 1045–1053. [PubMed] [Google Scholar] 34. Верма М.Дж., Ллойд А., Рейджер Х., Стритер Р., Кункель С., Тауб Д., Уэйкфилд Д. Хемокины при остром переднем увеите. Curr. Eye Res. 1997. 16: 1202–1208. [PubMed] [Google Scholar] 35. Абу эль-Асрар А.М., Ван Дамм Дж., Пут В., Векенир М., Драландс Л., Биллиау А., Миссоттен Л. Хемотаксический белок-1 моноцитов при пролиферативных витреоретинальных нарушениях.Являюсь. J. Ophthalmol. 1997; 123: 599–606. [PubMed] [Google Scholar] 36. Наказава Т., Хисатоми Т., Накадзава К., Нода К., Маруяма К., Ше Х., Мацубара А., Мияхара С., Накао С., Инь Ю. Хемоаттрактантный белок 1 моноцитов опосредует апоптоз фоторецепторов, вызванный отслоением сетчатки . Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 2007; 104: 2425–2430. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Куниката Х., Ясуда М., Айзава Н., Танака Ю., Абэ Т., Накадзава Т. Внутриглазные концентрации цитокинов и хемокинов при регматогенной отслойке сетчатки и эффект интравитреального триамцинолона ацетонида.Являюсь. J. Ophthalmol. 2013; 155: 1028–1037.e1. [PubMed] [Google Scholar] 38. Йошида Н., Икеда Ю., Нотоми С., Исикава К., Мураками Ю., Хисатоми Т., Энаида Х., Исибаши Т. Клинические доказательства устойчивой хронической воспалительной реакции при пигментном ретините. Офтальмология. 2013; 120: 100–105. [PubMed] [Google Scholar] 39. Фридман Дж., Изерович П. Провоспалительные цитокины в глаукомных водных и инцистированных пузырьках имплантата Molteno и их связь с давлением. Инвестировать. Офтальмол. Vis. Sci. 2013; 54: 4851–4855.[PubMed] [Google Scholar] 40. Иноуэ Т., Кавадзи Т., Инатани М., Камеда Т., Йошимура Н., Танихара Х. Одновременное повышение нескольких провоспалительных цитокинов в водянистой влаге в псевдофакичных глаукомных глазах. J. Cataract Refract. Surg. 2012; 38: 1389–1397. [PubMed] [Google Scholar] 41. Макги Санфтнер Л.Х., Рендал К.Г., Кирос Д., Койн М., Ладнер М., Мэннинг В.К., Фланнери Дж.Г. Рекомбинантная AAV-опосредованная доставка tet-индуцируемого репортерного гена в сетчатку крысы. Мол. Ther. 2001; 3: 688–696. [PubMed] [Google Scholar] 42.Lebherz C., Auricchio A., Maguire AM, Rivera VM, Tang W., Grant RL, Clackson T., Bennett J., Wilson JM Долгосрочная индуцируемая экспрессия гена в глазу посредством переноса гена аденоассоциированного вируса у нечеловеческих приматов . Гм. Gene Ther. 2005. 16: 178–186. [PubMed] [Google Scholar] 43. Stieger K., Le Meur G., Lasne F., Weber M., Deschamps JY, Nivard D., Mendes-Madeira A., Provost N., Martin L., Moullier P., Rolling F. Долгосрочное применение доксициклина. регулируемая экспрессия трансгена в сетчатке приматов, кроме человека, после субретинальной инъекции рекомбинантных векторов AAV.Мол. Ther. 2006; 13: 967–975. [PubMed] [Google Scholar] 44. Сочор М.А., Васиредди В., Дривас Т.Г., Войно А., Доунг Т., Шпылчак И., Бенничелли Дж., Чанг Д., Беннетт Дж., Льюис М. Автогенно регулируемая система экспрессии для генных терапевтических применений в области глаза. Sci. Отчет 2015; 5: 17105. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 45. Biswal M.R., Prentice H.M., Dorey C.K., Blanks J.C. Вектор генной терапии, специфичный для гипоксии, глиальных клеток, для нацеливания на неоваскуляризацию сетчатки. Инвестировать. Офтальмол.Vis. Sci. 2014; 55: 8044–8053. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 46. Shi Q., Zhang P., Zhang J., Chen X., Lu H., Tian Y., Parker TL, Liu Y. Экспрессия нейротрофического фактора мозга, опосредованная аденовирусом, регулируемая элементом ответа на гипоксию, защищает мозг от кратковременного повреждения. окклюзия средней мозговой артерии у мышей. Neurosci. Lett. 2009; 465: 220–225. [PubMed] [Google Scholar] 47. Рю М., Ясуда М., Ши Д., Шанаб А.Ю., Ватанабэ Р., Химори Н., Омодака К., Йокояма Ю., Такано Дж., Сайдо Т., Накадзава Т. Критическая роль кальпаина в гибели ганглиозных клеток сетчатки, вызванной повреждением аксонов. J. Neurosci. Res. 2012; 90: 802–815. [PubMed] [Google Scholar] 48. Нисигучи К.М., Карвалью Л.С., Рицци М., Пауэлл К., Холтхаус С.М., Азам С.А., Дюран Ю., Рибейро Дж., Луманн Ю.Ф., Бейнбридж Дж. У. Генная терапия восстанавливает зрение у мышей rd1 после удаления мешающей мутации в Gpr179. Nat. Commun. 2015; 6: 6006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 49. Цуда С., Танака Ю., Куниката Х., Йокояма Ю., Ясуда М., Ито А., Накадзава Т. Визуализация гибели RGC в реальном времени с помощью окрашивающего соединения непроницаемой для клеток нуклеиновой кислоты после повреждения зрительного нерва на мышиной модели. Exp. Eye Res. 2016; 146: 179–188. [PubMed] [Google Scholar] 50. Пруски Г.Т., Алам Н.М., Бикман С., Дуглас Р.М. Быстрая количественная оценка пространственного зрения взрослых и развивающихся мышей с использованием виртуальной оптомоторной системы. Инвестировать. Офтальмол. Vis. Sci. 2004. 45: 4611–4616. [PubMed] [Google Scholar]Театр Миллера при Колумбийском университете
Осень 2021 г.
Прямой эфир из Колумбии: всплывающие окна из кампуса Морнингсайд
Присоединяйтесь к нам на цифровые выступления Артуро О’Фаррилла и Afro Latin Jazz Orchestra, Симоны Диннерстайн и Yarn / Wire.
Присоединяйтесь к нам на цифровые выступления Артуро О’Фаррилла и …
БОЛЬШЕ ИНФОРМАЦИИ4/13
Слушайте наш подкаст о том, как создается классическая музыка
Проследите путь трех композиторов, создающих новые произведения.
Проследите путь трех композиторов, создающих новые …
БОЛЬШЕ ИНФОРМАЦИИЧасы по требованию
Выдающиеся выступления Миллера по запросу в любое время.
Выдающиеся выступления Миллера по запросу в любое время.
БОЛЬШЕ ИНФОРМАЦИИПослушать финальные работы
Наш подкаст завершается премьерой последних произведений, заказанных Маркосом Балтером, Кортни Брайан и Огастой Рид Томас
.Наш подкаст завершается премьерой финального заказа…
БОЛЬШЕ ИНФОРМАЦИИТеатр Миллера при Колумбийском университете
Осень 2021 г.
Прямой эфир из Колумбии: всплывающие окна из кампуса Морнингсайд
Присоединяйтесь к нам на цифровые выступления Артуро О’Фаррилла и Afro Latin Jazz Orchestra, Симоны Диннерстайн и Yarn / Wire.
Присоединяйтесь к нам на цифровые выступления Артуро О’Фаррилла и …
БОЛЬШЕ ИНФОРМАЦИИ4/13
Слушайте наш подкаст о том, как создается классическая музыка
Проследите путь трех композиторов, создающих новые произведения.
Проследите путь трех композиторов, создающих новые …
БОЛЬШЕ ИНФОРМАЦИИЧасы по требованию
Выдающиеся выступления Миллера по запросу в любое время.
Выдающиеся выступления Миллера по запросу в любое время.
БОЛЬШЕ ИНФОРМАЦИИПослушать финальные работы
Наш подкаст завершается премьерой последних произведений, заказанных Маркосом Балтером, Кортни Брайан и Огастой Рид Томас
.Наш подкаст завершается премьерой финального заказа…
БОЛЬШЕ ИНФОРМАЦИИИсследование по оптимизации, характеристике и реологии
Одним из способов повышения ценности отходов банановой кожуры «Saba» является извлечение ценных соединений, таких как пектин, и их использование в пищевых продуктах. В этом исследовании параметры экстракции пектина с помощью микроволнового излучения были проверены и оптимизированы с использованием методологии поверхности отклика.Пектин очищали, а затем подвергали характеристике. Результаты показали, что оптимальными условиями экстракции были 195 ° C, соотношение твердое вещество-жидкость 8% и соляная кислота (HCl) pH 3, с прогнозируемым и фактическим выходами 12,8% и 14,2% соответственно. Последующий метод очистки повысил чистоту пектина на 300%. Было обнаружено, что пектин имеет низкую метоксильную природу и средний размер частиц 300 нм. Применение пектина в изоляте сывороточного протеина привело к получению разжижающей сдвиг жидкости с улучшенной вязкостью по сравнению с контролем.Применительно к коммерческому апельсиновому соку исследование переваривания in vitro показало, что вязкость жидкости была выше до и во время желудочного и кишечного переваривания при низкой скорости физиологического сдвига.
1. Введение
Банан — это местный фрукт на Филиппинах, который продается круглый год. Это очень распространенная сельскохозяйственная продукция, поэтому в 2019 году Филиппины заняли второе место по объему мирового экспорта после Эквадора [1]. Один из самых популярных сортов — сорт «Саба» (Musa BBB «Saba» ( Musa acuminata x Musa balbisiana )), стебель которого достигает четырех метров в высоту.Одновременно в его пучках может быть от 8 до 16 рук, по 12-20 пальцев на каждой руке. Плоды короткие, толстые и очень угловатые, с толстой зеленой кожурой в незрелом состоянии и желтой кожурой при созревании. Мякоть кремово-белая, мелкая, с хорошо развитыми сердцевинами и редкими семенами. Сорт «Саба» обычно употребляют в свежем виде в созревшем состоянии и обрабатывают для придания разнообразия пищевому продукту.
Согласно последнему исследованию на Филиппинах, 25% чистого производства бананов в стране, или около 2 миллионов метрических тонн в 2019 году, приходится на переработку пищевых продуктов [2].Предварительные исследования показали, что после обработки образующиеся отходы составляют около двух третей веса свежего материала. Следовательно, потенциальное образование отходов при переработке бананов составляет более миллиона метрических тонн. Учитывая объем отходов, образующихся при переработке, которые в основном попадают на свалки, использование банановой кожуры для создания ценных продуктов, таких как пектин, является хорошим направлением для исследований.
Пектин используется в качестве желирующего агента, загустителя и стабилизатора пищевых продуктов, таких как джемы и желе.Его применение также распространяется на такие напитки, как фруктовые соки и безалкогольные напитки. Существенным преимуществом добавления пектина в пищу является то, что он сокращает время приготовления, улучшает текстуру и цвет и увеличивает срок хранения. Помимо его функции в качестве пищевого ингредиента, были также заявления о питательных свойствах пектина. Это растворимая клетчатка, которая может вытягивать воду из пищеварительной системы, образуя гель, который помогает замедлить пищеварение.
Экстракция с помощью микроволн, один из передовых способов экстракции пектина, продемонстрировала потенциал в экономии времени, энергии и расхода растворителя.Экстракция растворенных веществ из растительного материала с использованием микроволн включает проникновение растворителя в твердый материал, гидролиз, диффузию на поверхность и внешний массоперенос в раствор [3]. В частности, в фазе гидролиза энергия, поглощаемая тканью растения, вызывает объемный нагрев из-за дипольного вращения полярных молекул, что вызывает столкновение молекул, приводящее к генерации тепла внутри ткани растения [4]. Быстрое выделение тепла из-за микроволнового излучения также инактивирует пектинэстеразу, фермент, который взаимодействует и снижает растворимость пектиновых веществ [5].
Исследования, включающие экстракцию пектина с помощью микроволнового излучения, были выполнены для некоторых субстратов, включая маракуйю [6], кожуру кислого апельсина [7] и кожуру джекфрута [8]. Мощность микроволн, используемая для создания высокой температуры (в результате вращения диполя), необходимой для экстракции, варьировалась от 450 до 900 Вт. Между тем, оптимальное время экстракции для этих субстратов составляет от 2 до 20 минут, что короче, чем при традиционной экстракции с использованием подкисленной воды. Кроме того, для получения высокой мощности микроволн (высокая температура) использовалось более короткое время экспонирования.Слишком длительное воздействие высокой температуры обычно приводит к деполимеризации / разложению гидролизованного пектина, в результате чего получаются полимеры с низкой степенью полимеризации, которые не осаждаются в спирте [9].
Учитывая обилие отходов кожуры банана и понимание их жизнеспособности как источника пектина, целью данного исследования является повышение ценности отходов путем извлечения ценных пищевых ингредиентов из кожуры бананов. Что еще более важно, параметры экстракции с помощью микроволнового излучения были проверены и оптимизированы для максимального увеличения выхода пектина, а также свойств пектина из отходов кожуры банана.Наконец, было выполнено фактическое нанесение на пищевой продукт, чтобы оценить эффективность пектина в улучшении некоторых пищевых качеств.
Целью данного исследования является оценка и оптимизация параметров (температура, соотношение твердой и жидкой фаз (SLR) и pH) экстракции пектина из отходов кожуры банана «Saba» с помощью микроволн, определение характеристик пектина и оценка его загущающий эффект на напитки.
2. Материалы и методы
2.1. Материалы
Свежие кожуры зрелых незрелых бананов «Саба» были получены на заводе по переработке банановых чипсов в Санта-Крус, Мариндук, Филиппины.Его нарезали на мелкие кусочки (примерно 4 см 2 ), а затем высушили при 50 ° C до постоянного веса. Высушенную банановую кожуру измельчали с использованием настольного блендера (Oster®, Classic Series Accurate Blend ™, Бока-Ратон, Флорида) и хранили в эксикаторе при комнатной температуре (25 ° C). Обычные химические вещества и реагенты, если не указано иное, были чистыми для аналитического анализа, закупленными у Fisher Scientific, США.
2.2. Характеристика
Содержание влаги, общая зола, сырой жир и сырая клетчатка были определены в соответствии с протоколами, описанными в официальных методах анализа Ассоциации официальных химиков-аналитиков [10].
2.3. Экстракция в микроволновой печи отходов кожуры банана «Saba»
Экстракцию пектина проводили с использованием микроволнового варочного котла (Ethos UP High-Performance Microwave Digestion System, Milestone Srl, Италия) с регулируемой температурой и временем облучения. В зависимости от SLR, указанного в плане эксперимента, измельченные отходы кожуры банана «Saba» добавляли к соляной кислоте с различным pH. Смесь помещали в середину вращающегося диска микроволнового варочного котла и затем подвергали воздействию различных температур в течение определенного периода времени.Мощность микроволн, зарезервированная энергия, была установлена на уровне 1000 Вт. После процесса экстракции смесь охлаждали до комнатной температуры (25 ° C), а затем фильтровали с использованием качественной фильтровальной бумаги Grade 1 (11 мкм мкм). Фильтрат отделяли и медленно добавляли равный объем 95% () этанола при непрерывном перемешивании. Смесь инкубировали при 4 ° C в течение 2 ч. Полученный пектин, экстрагированный с помощью микроволн (MEP), выделяли фильтрованием. Его дважды промывали таким же объемом 95% () этанола, а затем сушили при 40 ° C до постоянного веса.Процент выхода рассчитывали с использованием следующего уравнения.
2.3.1. Факторный эксперимент для скрининга значимых параметров экстракции
Скрининг с использованием полнофакторного эксперимента был проведен для определения, какие из параметров экстракции с помощью микроволнового излучения имеют существенное влияние на выход пектина. Оценивались четыре параметра: температура (80-140 ° C), время (30-90 с), SLR (5-20% ()) и pH (1-3).
2.3.2. Оптимизация экстракции пектина с помощью микроволнового излучения
Центральная составная конструкция использовалась для создания комбинации параметров для экстракции пектина с помощью микроволнового излучения из отходов кожуры банана «Saba».Оценивались три параметра: температура (80-200 ° C), SLR (5-15% ()) и pH (1-3). Между тем, время облучения для экстракции было стандартизировано и составляло 60 с.
2.4. Статистический анализ
Design Expert Statistical Software 10 от Stat Ease, Inc. использовали для проведения статистических тестов как для факторных, так и для оптимизирующих экспериментов. Для ранее значимые основные эффекты параметров экстракции с помощью микроволнового излучения были выбраны из полунормального графика вероятности эффектов.При этом соответствующие звездные величины были получены из получившейся диаграммы Парето. Значимые параметры были подтверждены с помощью последующего дисперсионного анализа (ANOVA). Для последнего программа проанализировала ответы с помощью множественных регрессий, и полученные коэффициенты значимости были оценены с помощью -Test. Модель была разработана, и ANOVA определил ее приемлемость. После создания действующей модели оптимальные комбинации параметров извлечения были определены путем численной оптимизации.
2.4.1. Проверка оптимальных условий экстракции с помощью микроволнового излучения
Прогнозируемые оптимальные условия были подтверждены путем проведения экстракции пектина из отходов банановой кожуры «Saba» в трех экземплярах с помощью микроволнового излучения и сравнения выхода с прогнозируемым значением.
2,5. Очистка пектина, экстрагированного в микроволновой печи (MEP)
Высушенный MEP (5%) диспергировали в деионизированной воде. Смесь гомогенизировали с помощью дозатора (Kinematica, Polytron 10-35 GT, Люцерн, Швейцария) при 5000 об / мин в течение 5 минут, а затем перемешивали в течение 4 часов.Затем его центрифугировали (Thermo Fisher Scientific, Sorvall Lynx 6000, Osterode, Германия) при 10000 × g в течение 15 мин. Супернатант фильтровали через Miracloth для удаления любого оставшегося остатка. Объем фильтрата измеряли, и очищенный пектин, экстрагированный с помощью микроволн (PMP), осаждали путем добавления равного объема 95% этанола. Смесь центрифугировали, и PMP собирали фильтрованием с использованием Miracloth. Его подвергали сублимационной сушке (Labconco, FreeZone ™, Канзас-Сити, Миссури), и выход рассчитывали с использованием следующего уравнения.
2.6. Характеристика пектина
2.6.1. Содержание метоксила и эквивалентная масса
Эквивалентная масса и содержание метоксила были измерены с использованием метода, описанного Rangana [11].
2.6.2. Общий белок
Общий белок пектина измеряли с использованием протокола, описанного Уокером [12]. Раствор A получали растворением 1 г бицинхонината натрия (BCA), 2 г карбоната натрия, 0,16 г тартрата натрия, 0,4 г гидроксида натрия и 0,95 г бикарбоната натрия в 80 мл деионизированной воды.Раствор доводили до pH 11,25, используя 10 М гидроксид натрия, а затем разбавляли до 100 мл, используя деионизированную воду. Раствор B получали растворением 0,4 г пентагидрата сульфата меди в 8 мл воды. Затем раствор разбавляли до 10 мл. Раствор C был получен путем объединения растворов A и B в соотношении 50: 1 ().
Два миллилитра раствора C добавляли к 0,1 мл образца, перемешивали на вортексе, затем инкубировали при 60 ° C в течение 15 мин. Затем его охлаждали на ледяной бане до комнатной температуры (25 ° C).Оптическую плотность считывали против холостого опыта (без образца) при 562 нм. В качестве стандарта использовали 0-60 мкл г бычьего сывороточного альбумина (БСА). Концентрация белка в единицах BSA была получена из стандартной кривой.
2.6.3. Общее содержание пектинов
Общее содержание пектинов было измерено в соответствии с методом, описанным Блюменкранцем и Асбоэ-Хансеном [13]. Семь и пять десятых миллиграмма образца помещали в пробирку с магнитной мешалкой.Образец помещали в ледяную баню, добавляли 5 мл холодной серной кислоты и затем перемешивали для полного растворения материала. Медленно добавляли в общей сложности 1,25 мл деионизированной воды с последующим непрерывным перемешиванием в течение 5 минут. Добавляли еще 1,25 мл деионизированной воды, и раствор перемешивали в течение 5 минут. После полного переваривания образец фильтровали через шприцевой фильтр 0,45 мкм мкм. Отфильтрованный образец разбавляли до 1: 10.
Отбирали один миллилитр разбавленного образца / стандарта и переносили в пробирку на ледяной бане.К образцу добавляли шесть миллилитров холодной смеси серная кислота / тетраборат натрия (4,77 г тетрабората натрия в 1 л серной кислоты). Он был тщательно перемешан и оставался прохладным. Пробирки кипятили 5 мин при 100 ° C, а затем сразу помещали в ледяную баню. Добавляли одну десятую миллилитра 0,0125 М м-гидроксидифенила (0,15% в 0,5% гидроксиде натрия — хранимом при 4 ° C в контейнере, обернутом алюминиевой фольгой). Образец многократно перемешивали на вортексе до достижения комнатной температуры (25 ° C). Поглощение образца измеряли при 520 нм против холостого опыта через 20 мин.
Для стандарта использовали 0-100 мк г / мл галактуроновой кислоты в деионизированной воде. Для холостого опыта добавляли 0,1 мл 0,5% гидроксида натрия вместо м-гидроксидифенила. Что касается галактуроновой кислоты, общая концентрация пектинового вещества была получена по стандартной кривой.
2.6.4. Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR)
Приблизительно 12,5 мг пектина смешивали с 250 мг бромида калия. Смесь тонко измельчили и поместили в фильеру для формования гранул.Сила прикладывалась вручную для образования прозрачных гранул. Для измерения фона в камеру для образцов вставляли держатель гранул, содержащий бромид калия (без пектина) (Thermo Scientific, Nicolet NEXUS 670 FTIR, Мэдисон, Висконсин). Инфракрасное излучение (400–4000 см, –1 ) облучали образец с разрешением 4 см. –1 с интервалом данных каждые 1,928 см –1 для 64 сканирований. Полученные спектры использовали для идентификации соответствующих пиков. Коммерческий (CP Kelco, Genu®, Атланта, Джорджия) медленный низкометоксипектин (LMP) также был проанализирован для сравнения.
2.6.5. Распределение частиц по размерам
Пектин (1%) растворяли в деионизированной воде путем непрерывного перемешивания в течение 4 часов. Полученный раствор доводили до pH 6 и затем подвергали центрифугированию при 10,000 × g в течение 15 мин. Декантат отделяли, обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут для разрушения любых возможных агрегатов, а затем разбавляли до коэффициента 1000 деионизированной водой. Затем размер частиц измеряли при 25 ° C с использованием Zetasizer Nano Series (Malvern Instruments Limited, Вестборо, Массачусетс).Источником света служил гелий-неоновый лазер, а детектором — лавинный фотодиод (ЛФД).
2.7. Оценка загущающих свойств
2.7.1. Влияние на раствор изолята сывороточного протеина (WPI)
Загущающие свойства PMP тестировали в растворе протеина. Для достижения эффекта соотношения смешивания пектин растворяли в растворе WPI таким образом, чтобы отношения (а) концентрации WPI к концентрации пектина составляли 5, 10 и 15. Конечный pH был доведен до 5, используя 0.1-0,5 М соляной кислоты или гидроксида натрия.
Для воздействия на pH пектин растворяли в растворе WPI таким образом, чтобы отношение концентрации WPI к концентрации пектина составляло 10. Конечный pH доводили до 4, 5 и 6, используя 0,1-0,5 М соляной кислоты. кислота или гидроксид натрия.
Полученную смесь гомогенизировали при 3000 об / мин в течение 30 с. Его подвергли одному циклу замораживания и оттаивания (FT), что эквивалентно 24 часам замораживания при -18 ° C и 24 часам оттаивания при 10 ° C.Для каждого условия pH готовили контроль, состоящий из раствора WPI без пектина. Кроме того, инкубация при 10 ° C в течение 48 часов также проводилась для имитации условий без замораживания.
Полученный комплекс осторожно переносили на нижнюю пластину реометра, а излишки удаляли с помощью пластикового шпателя после опускания головки реометра в положение обрезки. Испытания на вязкость при различных скоростях сдвига (2-200 с -1 ) проводили при 25 ° C.
2.7.2. Переваривание обогащенного пектином апельсинового сока in vitro
Влияние пектина на вязкость апельсинового сока при переваривании in vitro было протестировано в соответствии с протоколом, используемым для пищевых волокон [14], с небольшими изменениями. Пятнадцать граммов апельсинового сока Simply®, содержащего 2% PMP / LMP (), переносили в колбу Эрленмейера на 125 мл со стеклянными шариками. Добавляли семь миллилитров искусственной желудочной жидкости (SGF: 0,2% хлорида натрия () в 0,7% соляной кислоте ()). SGF также содержит пепсин, конечная концентрация которого составляет 3.2 мг / мл. Конечный раствор доводили до pH 2,0, используя 0,1-0,5 М соляную кислоту. Затем его инкубировали на водяной бане со встряхиванием при 37 ° C и скорости 175 об / мин в течение 2 часов для имитации желудочного пищеварения. Вязкость при физиологических скоростях сдвига [15] измеряли до инкубации и через 1 и 2 часа.
К раствору, используемому для пищеварения желудка, 2 мл 750 мМ хлорида кальция, 4,6 мл моделированной желчной жидкости (SBF: содержит 8 мг / мл солей желчных кислот) и 12 мл моделированной кишечной жидкости (SIF: 5 мг / мл. панкреатин растворен в 0.5 М натрий-фосфатный буфер; pH 7,8). Инкубация при встряхивании продолжалась 2 ч. Вязкость раствора измеряли в первый час и в конце переваривания.
3. Результаты и обсуждение
3.1. Химический состав отходов банановой кожуры «Saba»
Основным компонентом свежих отходов банановой кожуры «Saba» была вода (86%). Другие пищевые компоненты, включая золу (1,79%), сырой жир (1,11%) и сырую клетчатку (0,74%), были обнаружены в минимальных количествах.
3.2. Экстракция пектина с помощью микроволновой печи
3.2.1. Скрининг значимых параметров экстракции
Факторный эксперимент был проведен для скрининга и определения значимых параметров для экстракции пектина с помощью микроволн из отходов кожуры банана «Saba». Выход сырого пектина (данные не показаны) составлял 1-10%. ANOVA (данные не показаны) показал, что единственным значимым () индивидуальным параметром был SLR. Кроме того, было обнаружено, что двустороннее взаимодействие между SLR и температурой и трехстороннее взаимодействие между температурой, SLR и pH является значительным ().Наибольшее влияние на выход пектина оказывает трехстороннее взаимодействие, за ним следует двухстороннее взаимодействие и SLR, соответственно.
Известно, что идентифицированные важные параметры имеют решающее значение в процессе экстракции пектина. Для экстракции с помощью микроволнового излучения микроволновая печь обеспечивает быструю передачу энергии растворителю. Это приводит к дипольному вращению молекул воды и, как следствие, к быстрому повышению температуры системы. Давление внутри клетки растительного материала также увеличивается, разрушая клеточную стенку и позволяя высвобождать компоненты растительного материала [16].Тепло также инактивирует пектинэстеразу, фермент, который гидролизует метилэфирную связь пектина и превращает последнюю в пектат и этанол [17]. Таким образом, концентрация пектина для потенциальной экстракции подходящим растворителем, которым была разбавленная соляная кислота, была выше.
Разбавленная соляная кислота является полярным растворителем и может эффективно поглощать микроволновую энергию [18], обеспечивая необходимое тепло для экстракции пектина из отходов кожуры банана «Saba». Соответствующий pH растворителя, взаимодействие которого с другими параметрами было обнаружено значительным, обеспечивает кислотную природу системы и инициирует гидролиз пектина из протопектина [5].Оптимальный pH для экстракции пектина варьировал от 1 до 3 [19, 20] в соответствующих исследованиях.
Значение SLR и его взаимодействия с другими параметрами было связано с влиянием площади поверхности на извлечение. При более низком SLR площадь поверхности большая, и ожидается эффективный массоперенос. Это связано с улучшенным контактом растительного материала с экстрагирующим растворителем [21].
3.2.2. Оптимизация и проверка оптимальных параметров экстракции с помощью микроволнового излучения
Три параметра (температура, SLR и pH), определенные в факторном эксперименте, были рассмотрены для исследования оптимизации.ПЗС-матрица (таблица 1) использовалась для генерации комбинации параметров, поскольку она обеспечивает относительно высокое качество прогнозирования по всему пространству проекта и не требует использования точек за пределами исходного диапазона [22]. Результаты показали, что диапазон экстрагированного микроволнами пектина (MEP) составлял от 0,3 до 14% с максимальным выходом выше, чем в факторном эксперименте. После подгонки результатов к уравнению второго порядка была сгенерирована квадратичная модель. Основываясь на ANOVA (данные не показаны), температура и pH были значимыми () индивидуальными параметрами.Их двухстороннее взаимодействие также было значительным () и квадрат SLR.
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Модель поверхности отклика (рисунок 1) показывает, что выход пектина увеличивается при повышении температуры примерно до 140-190 ° C.Кроме того, доходность начала снижаться. Эта тенденция была однородной независимо от взаимодействия температуры с другими параметрами. Возможно, что на нижнем пределе температуры недостаточно для эффективного разрушения тканей растения, в то время как на верхнем пределе температурного диапазона произошел возможный гидролиз пектина и фактическая деградация исходного материала. Связанное с этим исследование влияния микроволн на экстракцию пектина из кожуры апельсина с использованием разбавленной соляной кислоты сообщило о разрушительном влиянии выделяемого тепла на структуру кожуры апельсина, что приводит к расщеплению клеток [16].
Уровень влияния pH на выход пектина был ниже, чем влияние температуры. Как правило, выход пектина снижался по мере увеличения кислотности экстрагирующего растворителя, за исключением случаев, когда температура экстрагирующего растворителя была на верхнем пределе.
Уравнение модели с точки зрения закодированных параметров показано в следующем уравнении где A — температура, B — SLR, C — pH. Модель предсказывала, что оптимальными условиями процесса были 8% () SLR, pH 3 HCl и 195 ° C с выходом 12.8%. После проверки доходность увеличилась на 11% от прогнозируемой. Полученный выход был больше, чем у пектина, экстрагированного с помощью микроволн из маракуйи (13%) [6], но ниже, чем у кожуры джекфрута (17%) [8] и цедры кислого апельсина (38%) [23].
После определения характеристик чистота МЕР составила 8,83%. После повторной очистки (повторного растворения и повторного осаждения) MEP был получен очищенный пектин, экстрагированный с помощью микроволн (PMP). PMP имеет чистоту 25,78%. Как и ожидалось, повышение чистоты привело к снижению выхода — с 14.От 2% до 4,8%. Указанная ценность ниже, чем у ранее упомянутых маракуйи, цедры джекфрута и цедры кислого апельсина.
3.3. Характеристики пектина
3.3.1. Химический состав
Результаты показали, что эквивалентная масса MEP (приблизительно 2300 г / экв) была выше, чем его очищенный аналог, PMP (1500 г / экв). Из-за сырой природы MEP, он может содержать другие группы, которые способствовали удельному весу пектина по сравнению с замещаемым водородом. Более того, более низкий эквивалентный вес PMP может быть отнесен на счет более высокой частичной деградации во время экстракции [24].Что касается содержания метоксила, как MEP (0,16%), так и PMP (2,01%) были в пределах нормы (0,1-7%) для низкометоксипектина [25].
Общее содержание пектинов, определяющее чистоту пектина, было основано на появлении хромагена при взаимодействии уроновой кислоты (при нагревании при 100 ° C с серной кислотой / тетраборатом) с мета-гидроксидифенилом. Результаты показали, что чистота MEP и PMP составляла 9% и 26% соответственно.
Содержание белка для MEP и PMP составляло 0,5% и 1.4% соответственно. Количество белка в пектине является важным фактором при некоторых пищевых применениях, особенно в эмульсии. Белок действует как якорь между пектином и образующимися каплями масла в эмульсии, что приводит к более стабильной системе [26].
3.3.2. Профиль FTIR
Для анализа FTIR были рассмотрены полосы от 1800-1500 см -1 . Это область отпечатка пальца пектина, где соответствующие функциональные группы поглощают энергию инфракрасного источника [7].На рисунке 2 показано, что как MEP, так и PMP демонстрируют пики поглощения в области около 1630–1600 см –1 , что объясняет симметричное растягивающее колебание карбоксильной группы. Пик около 1740 см -1 , который описывает растяжение связи C = O как в сложноэфирной, так и в карбоксильной группах, также присутствовал в LMP, но не в MEP и PMP. Эти данные подтвердили результат характеристики, согласно которой LMP (7,61%) имеет больше метоксильных групп, чем MEP (0,16%) и PMP (2,01%). Несмотря на различия, содержание метоксильных групп всех трех пектинов находится в пределах нормального диапазона для низкометоксипектина, который равен 0.1-7% [25].
3.3.3. Распределение частиц по размерам
Размер частиц материалов, таких как пищевые ингредиенты, особенно важен в пищевой промышленности. Знание размеров частиц влияет на производство ингредиентов и обращение с ними, а также на рецептуру, обработку и контроль качества пищевых продуктов и напитков. Среди нескольких методов определения размера частиц в этом исследовании использовалось динамическое рассеяние света. Принцип основан на броуновском движении, при котором мелкие частицы в постоянном случайном тепловом движении диффундируют со скоростью, зависящей от их размера.Чем меньше частицы, тем быстрее происходит диффузия.
Рисунок 3 показывает, что среди пектинов только MEP обладал несимметричным распределением частиц по размерам. Размер МЭП варьировался от 25 до 200 нм с модой (наиболее часто встречающийся размер) около 200 нм. Между тем, PMP демонстрировал симметричное распределение и разнообразие размеров в диапазоне от 35-150 нм до 200-600 нм с модой 300 нм. LMP, с другой стороны, имеет три диапазона размеров частиц: 30-100 нм, 200-900 нм и 5 мкм, м-6.5 мкм м.
3.4. Загустеваемость пектина
3.4.1. Влияние пектина на вязкость раствора WPI
Результаты измерения кажущейся вязкости (рис. 4) показали, что все смеси WPI-PMP проявляют свойство разжижения при сдвиге — уменьшение вязкости в ответ на увеличение скорости сдвига. Это реологическое свойство сходно с таковым у экстрагированного кислотой пектина [27] и других углеводов, таких как гуаровая камедь [28] и карбоксиметилцеллюлоза [29].
Соотношение смешивания и pH пектин-белкового комплекса влияют на реологические свойства жидкости. В этом исследовании изменение скорости сдвига не обобщало влияние соотношения смешивания и pH на вязкость. Однако при определенных скоростях сдвига можно оценить разницу в вязкости. Следовательно, пищевой процесс с известной скоростью сдвига может определить подходящее соотношение смешивания и pH для достижения желаемой вязкости жидкости. В зависимости от условий хранения замораживание и оттаивание приводили к почти такой же вязкости комплекса, как и без замораживания.
3.4.2. Влияние пектина на вязкость апельсинового сока при переваривании in vitro
Для реологических испытаний фруктового сока, обогащенного пектином, вязкость измеряли при физиологических скоростях сдвига: 10 и 50 с -1 [15], как показано на рисунке 5. Перед перевариванием не было значительной разницы между кажущейся вязкостью апельсинового сока, обогащенного PMP, и контроля (без PMP). Во время желудочного пищеварения и PMP, и LMP увеличивают вязкость апельсинового сока при низкой физиологической скорости сдвига.В то же время только LMP показал улучшенную вязкость при высокой скорости физиологического сдвига. В оставшиеся часы переваривания in vitro оба пектина улучшили вязкость сока при низкой скорости физиологического сдвига. Тем не менее, они показали ту же вязкость, что и контрольный образец, при высокой скорости сдвига. Этот вывод согласуется с результатами аналогичного исследования, в котором было обнаружено, что коммерческие марки пектина увеличивают вязкость апельсинового сока [30].
Исследование корреляции вязкости пищи с сытостью показало, что сытость во время еды выше для высоковязкой пищи [31].Следовательно, помимо улучшения текстуры сока, добавление PMP может повысить уровень насыщения во время еды. Для людей, заботящихся о своем здоровье, это может быть потенциальным вариантом диеты для поддержания здоровой массы тела.
4. Выводы
Это исследование показало, что микроволновое облучение можно использовать для извлечения пектина из отходов кожуры банана «Saba». Более того, модель, полученная для прогнозирования оптимальных условий экстракции с помощью микроволнового излучения, была действительной, о чем свидетельствует близкое соответствие между прогнозируемыми (12.8%) и фактический выход (14,2%) пектина. Идентифицированными значимыми параметрами (и соответствующими оптимальными условиями) были температура (195 ° C), SLR (8% ()) и pH (3, HCl). Дальнейшая очистка пектина, экстрагированного микроволнами (MEP), привела к более низкому выходу (5%), но более высокому качеству пектина (PMP, чистота 36%).
Реологические исследования показали, что комплекс WPI-PMP проявляет свойство разжижения при сдвиге. Более того, влияние как соотношения смешивания, так и pH можно оценить только при определенных скоростях сдвига.Что касается влияния пектина на вязкость апельсинового сока in vitro при переваривании , то улучшение вязкости наблюдалось при переваривании с низкой скоростью сдвига. В целом, пектин, экстрагированный с использованием оптимизированной экстракции с помощью микроволнового излучения, показал потенциал для использования в пищевых продуктах в качестве загустителя.
Доступность данных
Другие данные, кроме представленных в этом документе, доступны по запросу. Пожалуйста, отправляйте все сообщения д-ру Джоэлю П. Риваденейре по адресу [email protected].
Конфликт интересов
Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.
Благодарности
Это исследование финансировалось Программой ускоренного развития научных и технологических человеческих ресурсов Министерства науки и технологий Филиппин (DOST-ASTHRDP) и Национальным исследовательским советом Филиппин, Департамент науки и технологий (NRCP). -ДОСТ).
Луис М. Суарес Тата, Мэриленд
Av Andres E. Blanco c / calle 139 El Viñedo
Valencia, Carabobo, 33166
Карта Венесуэлы
+58 412-347-4188 другое
Биография
ESTUDIOS REALIZADOS
Высшее образование:
Institución: Universidad de Carabobo.Facultad de Ciencias de la Salud. Escuela de Medicina. Titulo obtenido: Médico Cirujano Período: 1987 — 1996.
Titulo Universitario de Especialista en Oftalmología emitido por la Universidad Central de Venezuela. Больница Мигеля Переса Карреньо. Аньо, 1998–2000.
Sub-especialidad en Vítreo-Retina. Больница «Др. Луис Санчес Булнес »Asociación para Evitar la Ceguera en México. Аньо, 2001–2003 гг. Доктор Хьюго Кирос.
MIEMBRO ACTIVO DE SOCIEDADES CIENTIFICAS
Sociedad Venezolana de Retina y Vitreo.
Sociedad Panamericana de Retina y Vitreo
Американское общество специалистов по сетчатке.
EuroLam Retina Society
TRABAJOS PRESENTADOS EN CONGRESOS
Факоаспирация с ИОЛ или без нее с бесшовной витрэктомией 25 калибра и задней капсулотомией при врожденной катаракте: описательное исследование. Суарес-Тата Луис; Суарес-Тата Моравия; Сайди Верде; Андреа Ламас. Американское общество специалистов по сетчатке глаза. ASRS Бостон. 11-15 августа 2017 г.
Сравнение частоты утечки склеротомии и необходимого наложения швов при трансконъюнктивальной витрэктомии 23 и 25.Январь 2010 г. / декабрь 2016 г. Суарес-Тата Луис; Суарес-Тата Моравия; Сайди Верде; Андреа Ламас. Американское общество специалистов по сетчатке глаза. ASRS Бостон. 11-15 августа 2017 года.
Использование Endoptik в осложненных случаях глазной травмы и отчет о непрозрачности прозрачных носителей по 36 случаям. 2011 — 2014. Клиника офтальмологии эль Винедо Валенсия. Венесуэла. Обслуживание сетчатки и стекловидного тела. Валенсия — Венесуэла. Суарес-Тата Луис. Американское общество специалистов по сетчатке глаза. ASRS Вена. 11-14 июля. 2015.
Использование Endo Optik® в осложненных случаях тяжелой глазной травмы и Отчет о непрозрачности прозрачных носителей по 11 случаям.Clinica Oftalmológica El Viñedo
Служба сетчатки и стекловидного тела. Валенсия — Венесуэла. Суарес-Тата Луис; Суарес-Тата Моравия; Родригес Санна Л., Гарсиа Рейнальдо; Родригес Гонсалес Л. Американское общество специалистов по сетчатке глаза. Лас-Вегас, 25–29 августа 2012 г.
Сообщите о заболеваемости инфекционным эндофтальмитом, связанным с интравитреальными инъекциями ангиогенного средства в Clinica Oftalmológica El Viñedo в течение 2008–2010 гг.
Обслуживание сетчатки и стекловидного тела. Валенсия — Венесуэла. Суарес-Тата Луис; Суарес-Тата Моравия; Родригес Санна Л., Гарсиа Рейнальдо; Родригес Гонсалес Л.Американское общество специалистов по сетчатке глаза. Лас-Вегас, 25–29 августа 2012 г.
Использование эндоптики и осложнений при травмах глаза. Simposio de Trauma del Segmento Posterior. Луис Суарес-Тата. Clínica Oftalmológica El Viñedo. Валенсия Венесуэла. VI Sociedad Panamericana de Retina y Vítreo (SPRV). XV FORO GLADAOF Mayo 16–19 2012.
Incidencia de Endoftalmitis Infecciosa Asociada a las Inyecciones Intravítreas de
Antiangiogénicos 2008-2010. Суарес-Тата Л., Гарсия Р., Родригес-Санна Л.,
Родригес-Гонсалес Л., Суарес-Тата М.Clínica Oftalmológica El Viñedo. Валенсия Венесуэла. Sociedad Panamericana de Retina y Vítreo (SPRV). 16 — 19 мая 2012 г.
Внутриглазные инородные тела заднего сегмента. Клинико-эпидемиологические особенности. 2007-2009 Научный плакат. «Clinica Oftalmologica el Viñedo. Сетчатка и стекловидное тело ». Валенсия Венесуэла. Суарес-Тата Л; Суарес-Тата М; Родригес Л., Гарсия Р. Портильо Н. Американское общество специалистов по сетчатке глаза. Бостон. 20 — 24 августа 2011. (365)
Использование триамцинолона для вспомогательной витрэктомии и Brillant Blue для окрашивания внутренней ограничивающей мембраны при хирургии макулярного отверстия и эпиретинальной мембране.«Clinica Oftalmologica el Viñedo. Сетчатка и стекловидное тело ». Валенсия Венесуэла.
Suarez-Tatà L; Суарес-Тата М; Родригес Л., Гарсия Р. Специалист Американского общества сетчатки глаза. Ванкувер. 27 августа — 1 сентября 2010 г. (1213)
Отдаленный результат комбинированной витрэктомии pars plana и имплантации склерально-фиксированной зашитой линзы задней камеры. «Clinica Oftalmologica el Viñedo. Сетчатка и стекловидное тело ». Валенсия Венесуэла. Суарес-Тата Л; Суарес-Тата М; Родригес Л., Гарсия Р.; Ория В.Американское общество специалистов по сетчатке глаза. Нью-Йорк . 30 сентября — 4 октября 2009 г. (419)
Hemorragia subretinal masiva luego de trauma en un paciente con impresionantes estrias angioides. Гарсия Р.А., Ория V, Суарес Тата Л.М., Альенде А., Суарес-Тата М. III Конгресс-де ла Сосьедад Панамерикана де Сетчатка и Витрео (XII форум GLADAOF). Остров Маргарита, Венесуэла, Майо, 7–10 .. Финальная программа 2008 г. Стр. 41.
Sildenafil Induciendo Multiples desprendimientos retinales sero-sanguinolentos en un paciente con Vasculopatia Polipoidea Idiopatica Suárez-Tata LM, Garcia-Tata, Suárez-Tata LM, Garcia-Vata, Suárez-Tata JF, Кортез Р.. III Congreso de la Sociedad Panamericana de Retina y Vitreo (XII форум GLADAOF). Остров Маргарита, Венесуэла, Майо, 7–10.2008 Заключительная программа Стр. 45.
Ранибизумаб интравитрео после лечения с бевацизумабом и дегенерацией макулярной релаксации в эдаде (DMRE) Хумеда. Гарсия Р.А., Альфаро В., Керрисон Дж., Родригес-Фонталь М., Хаблон Э.П., Ория В., Суарес Тата Л.М. III Congreso de la Sociedad Panamericana de Retina y Vitreo (XII форум GLADAOF). Остров Маргарита, Венесуэла Майо 7-10. Финальная программа 2008 г. Стр.29.
Manejo de Edema Macular Pseudofaquico. Синдром де Ирвин-Гасс. Estudio Retrospectivo en la Clinica Oftalmologica El Vinedo 2006-2007. Суарес-Тата Л.М., Гарсиа Р.А., Суарес-Тата М., Ория V, Родригес Л. III Конгрессо де ла Сосьедад Панамерикана де Сетчатка и Витрео (XII форум GLADAOF). Остров Маргарита, Венесуэла Майо 7-10. Заключительная программа 2008 г. Стр. 31.
Бевацизумаб Интравитрео для лечения витрэктомии с тапонамином с кремнием и ретинопатией Diabetica Proliferativa Severa.III Congreso de la Sociedad Panamericana Суарес-Тата Л.М., Гарсия Р.А., Суарес-Тата М., Герреро-Наранхо Дж. Л., Санчес Дж., Аревало Дж. Ф. de Retina y Vitreo (XII форум ГЛАДАОФ). Остров Маргарита, Венесуэла Майо 7-10. 2008. Заключительная программа, стр. 35.
Сравнительный анализ ранибизумаба и бевацизумаба, анатомический результат и функциональность .. Суарес-Тата, Л.М. Клуб ангиографии / ОКТ / Конференция интересных кейсов. III Congreso de la Sociedad Panamericana de Retina y Vitreo (XII форум GLADAOF). Остров Маргарита, Венесуэла, 7-10 мая.2008. CF15, Final Program Pg 23.
Интравитреальный бевацизумаб как адъювант к витрэктомии с тампонадой силиконового масла при пролиферативной диабетической ретинопатии: анатомические и визуальные результаты. Л.М. Суарес Тата1, М.Суарес-Тата1, Х.Л. Герреро-Наранхо2, Дж.Санчес3, Х.Аревало. 25-е ежегодное собрание Американского общества специалистов по сетчатке глаза, Палм-Спрингс, 1–5 декабря 2007 г.
Интравитреальный бевацизумаб (авастин) в качестве адъюванта к витрэктомии с тампонадой силиконового масла при тяжелой пролиферативной диабетической ретинопатии (ПДР): анатомические и визуальные результаты.Л.М. Суарес Тата1, М.Суарес-Тата1, Х.Л. Герреро-Наранхо2, Дж.Санчес3, Х.Аревало3. 1 Офтальмологическая клиника Эль Виньедо, Валенсия, Венесуэла; 2 Госпиталь Превенир ла Сегера Луис Санчес Булнес, Мексика. 3.Clinica Oftalmológica Centro Caracas, Венесуэла. ARVO, 28 апреля 2 мая. 2007 г. Форт-Лодердейл, Флорида.
Реакция заднего воспаления при витрэктомии с перфторуглеродом по сравнению с солевым раствором при эндофтальмите экспериментально. Суарес-Тата, L; Quiroz-Mercado H; Родригес-Рейес, А; Ванццини-Заго, V; Герреро-Наранхо, JL; Мурильо-Лопес, С.Congreso Venezolano de Oftalmologia 2006.
Facoemulsificacion en ojos post-vitrectomia pars plana. Суарес-Тата, L; Quiroz-Mercado H; Родригес-Рейес, А; V; Герреро-Наранхо, JL; Мурильо-Лопес, С. Congreso Venezolano de Oftalmologia 2006.
Malformación Orbitaria Venoso-Linfática sin Flujo Diagnóstico Ecográfico. Caso Clinico. Суарес-Тата М., Веласко-Барона К.Ф., Родригес-Рейес А., Суарес-Тата Л., Морагрега-Адаме Э. Госпиталь «Доктор. Луис Санчес Булнес »Asociación para Evitar la Ceguera en México I.A.P. México City, Мексика. Congreso Venezolano de Oftalmologia 2006.
Пневмодмещение субмакулярного кровоизлияния, вторичного по отношению к травматическому разрыву хориоидеи (Доска B752) G. Reategui-Escalante, J. Dalma-Weiszhausz., V. Morales-Canton, S.Murillo-Lopez, S. Тата, М. Турати. Retina, АТЭС, Мексика, Мексика. ARVO Mayo 4-9. 2003 г. Форт-Лодердейл, Флорида.
Исследование токсичности перфторуглеродных жидкостей по сравнению со сбалансированным солевым раствором в человеческих линзах (Board B192) G. Garcia-Aguirre, J.Л. Герреро-Наранхо, Л. М. Суарес-Тата, С. Мурильо-Лопес, Г. Реатеги-Эскаланте, К. Лейсаола-Фернандес, Л. Морфин-Салидо, Д. Риос-Валлес, А. Родригес-Рейес, Х. Кирос -Mercado. Retina, Patology, Asociación para Evitar la Ceguera en México, Мехико, Мексика. ARVO Mayo 4 — 9. 2003. Форт-Лодердейл, Флорида.
Витрэктомия с использованием непрерывной инфузии оксигенированных (ViCIOP) и не оксигенированных перфторуглеродов (ViCIP). Новый метод витрэктомии (Board B807) H. Quiroz-Mercado, J. Guerrero-Naranjo, L.Суарес-Тата, С. Мурильо-Лопес, Г. Реатеги, К. Лейсаола-Фернандес, Г. Гарсия, Л. Морфин, С.Т. Чарльз. Retina Service, APEC, Мехико, Мексика; Кафедра офтальмологии, Университет Теннесси, Мемфис. ARVO Mayo 4-9. 2003 г. Форт-Лодердейл, Флорида.
Витрэктомия с использованием непрерывной инфузии оксигенированных перфторуглеродов (ViCIOP) у пациентов с тяжелой пролиферативной диабетической ретинопатией и тракционной отслойкой сетчатки. Анатомические и визуальные результаты (Доска B701) L .M. Суарес-Тата, Х.Кирос-Меркадо, Х. Герреро-Наранхо, С. Мурильо-Лопес, Дж. Реатеги-Эскаланте, К. Лейсаола-Фернандес, Дж. Гарсия, Л. Морфин, С. Чарльз. Retina, Asociació n para Evitar la Ceguera, Мехико, Мексика; Отделение офтальмологии, Университет Теннесси, Мемфис, Теннесси .. ARVO Mayo 4–9. 2003 г. Форт-Лодердейл, Флорида.
Эффективность витрэктомии с полным удалением заднего гиалоида при лечении ишемической окклюзии центральной вены сетчатки (CRVO) (Board B768) J. Guerrero, L. Suarez-Tata, C. Leizaola-Fernandez, J.Хименес-Сьерра, Х. Кирос-Меркадо. Retina, Asoc para Evitar la Ceguera, Мехико, Мексика. ARVO Mayo 4-9. 2003 г. Форт-Лодердейл, Флорида.
Витрэктомия с непрерывным введением оксигенированных перфторуглеродов (VICIOP) Уго Кирос-Меркадо, доктор медицины, Луис Суарес-Тата, доктор медицины, Херардо Гарсиа-Агирре, доктор медицины, Леопольдо Морфин-Салидо, доктор медицины, Серджио Мурильо-Лопес, Л. Герреро-Наранхо, доктор медицины. Video Presentado ru Четвертый ежегодный кинофестиваль общества стекловидного тела 20-е ежегодное собрание общества стекловидного тела и 35-е ежегодное собрание общества стекловидного тела.Сан-Франциско, 28 сентября — 1 октября 2002 г. Годы великих видеоклипов и новых технологий.
Витрэктомия с непрерывной инфузией оксигенированных перфторуглеродов (ViCIOP) Хьюго Кирос-Меркадо, доктор медицины, Луис Суарес-Тата, доктор медицины, Херардо Гарсия-Агирре, доктор медицины, Руди Магдаленик, доктор медицины, Морозе Луис Герреро-Наранхо, доктор медицины , MD. Trabajo presentado ru 20-е ежегодное собрание общества стекловидного тела и 35-е ежегодное собрание общества сетчатки глаза. Сан-Франциско 28 сентября — 1 октября 2002 г.
Эффективность витрэктомии и индуцированного импульсным электронным лавинным ножом ретинохориоидального анастомоза в лечении окклюзии центральной вены сетчатки Вирджилио Моралес-Кантон, доктор медицины.Уго Кирос-Меркадо, доктор медицины. Марк С. Блюменкранц, доктор медицины. Хуан Мануэль Хименес, доктор медицины. Хосе Луис Герреро-Наранхо, доктор медицины. Луис Суарес-Тата, доктор медицины, Даниэль В. Паланкер, доктор философии, презентация на симпозиуме 5: Сосудистые заболевания сетчатки на 20-м ежегодном собрании общества стекловидного тела и 35-м ежегодном собрании общества сетчатки глаза Сан-Франциско 28 сентября — 1 октября 2002 г.
Витрэктомия с непрерывной инфузией оксигенированных перфторуглеродов (ViCIOP) Уго Кирос-Меркадо, доктор медицины, Луис Суарес-Тата, доктор медицины, Херардо Гарсия-Агирре, доктор медицины, Арайя, доктор медицины, Леопольдо Морфин-Салидо, доктор медицины Хосе Луис Гуэрхореро, доктор медицины Руди Магдаленик.Trabajo presentado en Встреча клуба Жюля Гонена, Монтрё, Швейцария. 31 августа — 4 сентября 2002 г.
Витрэктомия с применением оксигенированных и переработанных перфторуглеродов (VAPOR). Новый метод витрэктомии. РЕАКТ, шестой ежегодник. Сидней, Австралия. Abril 2002.
Витрэктомия с применением оксигенированных и переработанных перфторуглеродов (VAPOR). Новый метод витрэктомии. Герцог 13-й, Продвинутый курс хирургии стекловидного тела. Дарем, Северная Каролина. Mayo 2002
VRT-1001 в качестве адъюванта при пневматической ретинопексии R.Магдаленик, Х. Кирос-Меркадо, Х.Л. Герреро-Наранхо, Л. Суарес-Тата, Г. Карпио, Д. Кастильехос, Х.Л. Гутьеррес, В. Карагеозян. [ARVO Abstract] Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002; 43 (4). Abstract № 632
Эффективность витрэктомии и ретинохориоидального анастомоза, индуцированного эндолазером высокой мощности, в лечении ишемической окклюзии центральной вены сетчатки (CRVO) Л.М. Суарес-Тата, Х.М. Кирос-Меркадо, Х.М. Хименес-Сьерра, Х.Ларан Герреро, Дж. Руис-Крус, Р. Магдаленич. [ARVO Abstract] Invest Ophthalmol Vis Sci.2002; 43 (4). Abstract № 3520.
Проникающая травма глаза с сохраненным внутриглазным инородным телом: эпидемиологические факторы, клинические особенности и визуальный результат: С.А. Мурильо-Лопес, А. Перес, Ф. Эрнандес, Л. Суарес-Тата, Р. Магдаленик, Х. Фромоу , J. Dalma-Weiszhausz. Retina, APEC, Мексика. ARVO Abstract] Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002; 123 (4). Abstract № 3059.
Проникающая травма глаза с задержкой внутриглазного инородного тела: корреляция визуальных результатов с оценкой системы оценки травмы глаза: J.Х. Фромов-Герра, С. Мурильо-Лопес, А. Перес, Ф. Эрнандес, Л. Суарес-Тата, Р. Магдаленич, Х. Далма-Вайсхаус. Retina, APEC, Мексика. ARVO Abstract] Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002; 179 (4). Реферат № 4500.
Определение пролактина в тканях и жидкостях глаза у больных ретинопатией недоношенных 5 стадии. Луис Суарес-Тата, доктор медицины. Уго Кирос-Меркадо, доктор медицины. Зульма Дуэньяс, MsC. Хосе Луис Герреро-Наранхо, доктор медицины. Даниэль Очоа-Контрерас, доктор медицины. Ана Суарес-Ликона, доктор медицины. Павел Монтес де Ока, MSC. Гонсало Мартинес де ла Эскалера, доктор философии.Кармен Клэпп, доктор философии. Общество стекловидного тела, Сан-Хуан, Пуэрто-Рико, 2001. Презентация плаката в Обществе стекловидного тела. Пуэрто-Рико, ноябрь 2001 г.
Превосходная блефаропластия: Uso del 2-octilcianocrilato vs sutura de seda. Алегрия Амран Бенхимол, доктор медицины Тельма Родригес, доктор медицины, Луис М. Суарес Тата, доктор медицины Трабахо, представляющий в XXIII Панамерикано де Офтальмология в Аргентине, 21 июля 25 июля 2001 года.
Энфермедад де Кастлеман. A propósito de un caso.
Презентация плаката на VII Венесоланском конгрессе офтальмологии.Каракас 1999
Пальпебральный паракокцидиодомикоз. A propósito de un caso.
Презентация плаката на VII Венесоланском конгрессе офтальмологии. Каракас 1999
Manejo de Traumatismo Ocular Contuso Severo con sospecha de hemorragia Retrobulbar. A Propósito de un caso. Презентация плаката на VII конгрессе Венесолано де Офтальмология. Caraballeda, 1998.
Неоперабельная макроаденома Hipofisario. A Propósito de un caso. Презентация плаката на VII Национальном конгрессе офтальмологии.Caraballeda, 1998.
Bromocriptina: Tratamiento de elección en Macroprolactinoma Poster Presentado en el VII Congreso Nacional de Oftalmología. Caraballeda, 1998
Lesiones Conjuntivales Melanocíticas. Hospital Universitario Enero 1994 — Agosto 1996. Presentado en el XLV Congreso Nacional de Oftalmología. Maracaibo, 1997.
Metástasis conuntival de linfoma gástrico No-Hodgkin diffuso linfocítico de células pequeñas. Презентация плаката на XLV Национальном конгрессе офтальмологии.Maracaibo, 1997.
TRABAJOS PUBLICADOS
Quiroz-Mercado H, Guerrero-Naranjo J, Agurto-Rivera R, Leizaola-Fernandez C, Suarez-Tata L, Murillo-Lopez S, Reategircia-Escalante G, Реатеги-Эскаланте G Fromow-Guerra J. Перфторуглеродная перфузия витрэктомии: новый метод витрэктомии — исследование безопасности и технико-экономического обоснования. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2005 Jun; 243 (6): 551-62.
Витрэктомия с полным удалением заднего гиалоида при ишемической окклюзии центральной вены сетчатки: серия случаев.Лейсаола-Фернандес С., Суарес-Тата Л., Кирос-Меркадо Н., Колина-Лукес Дж., Фромоу-Герра Дж., Хименес-Сьерра Ю.М., Герреро-Наранхо Ю.Л., Моралес-Кантон В.Б.М.К. Офтальмол. 2005 20 мая; 5 (1): 10.
Перфторуглеродная перфузия витрэктомии: новый метод витрэктомии — исследование безопасности и технико-экономического обоснования. Quiroz-Mercado H, Guerrero-Naranjo J, Agurto-Rivera R, Leizaola-Fernandez C, Suarez-Tata L, Murillo-Lopez S, Reategui-Escalante G, Garcia-Aguirre G, Fromow-Guerra. J.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2004 17 декабря.
Хирургия факоэмульсификации катаракты при витрэктомии глаза. Суарес-Тата М., Вилласеньор-Диез Дж., Суарес-Тата Л.М., Суарес-Ликона А.М., Гарсия-Гардуно Л.М., Кирос Меркадо Н., Вильяр Кури Дж. Арч Соц Эсп Офтальмол. 2004 ноя; 79 (11): 531-6.
Перфторуглеродная перфузированная витрэктомия: исследования на животных. Quiroz-Mercado H, Suarez-Tata L, Magdalenic R, Murillo-Lopez S, Garcia-Aguirre G, Guerrero-Naranjo J, Rodriguez-Reyes AA. Am J Ophthalmol. 2004 Февраль; 137 (2): 287-93.
Двусторонние кисты желтого пятна, вторичные после поражения электрическим током.Отчет о болезни. Manrique-Cerrillo M, Murillo-Lopez S, Leizaola-Fernandez C, Quiroz-Mercado H, Guerrero-Naranjo JL, Vargas-Castillo R, Suarez-Tata L. Arch Soc Esp Oftalmol. 2004 Янв; 79 (1): 37-9.
Увеличенное пятно диодного лазера с использованием непрямого офтальмоскопа в сочетании с индоцианиновым зеленым для лечения крупных неоваскуляризаций хориоидеи. Реатеги-Эскаланте Г., Мурильо-Лопес С.А., Ромеро-Кастро Р.М., Суарес-Тата Л.М., Герреро-Наранхо Д.Л., Кирос-Меркадо Х. Офтальмологические хирургические лазеры. 2003 ноябрь-декабрь; 34 (6): 446-50.
Presencia de retinopatía diabética en pacientes con retinitis pigmentosa. Докладчик двух случаев: д-р Хуан Пабло Синистерра-Пава, д-р Хуан Мануэль Хименес-Сьерра, д-р Уго Кирос-Меркадо, д-р Луис Суарес Тата, д-р Серхио Мурильо-Лопес. Rev Mex Oftalmol Noviembre-Diciembre 2002; 76 (6): 232-237.
Reporte de Caso. Melanoma de Coroides fotocoagulado con láser de Diodo 810 nm coadyuvado con Verde de Indocianina: Мурильо Лопес С.А., Суарес Тата Л.М., Синистерра Пава Дж.Archivos de la Sociedad Española de Oftalmología N ° 10. Octubre 2002
Reacción posterior a vitrectomía con perfluorocarbonado vs. solución salina en endoftalmitis экспериментально: д-р Луис Суарес-Тата, д-р- Уго Кирос-Меркадо, д-р Хьюго Кирос-Меркадо. Агирре, д-р Серхио Мурильо-Лопес, д-р Леопольдо Морфин-Салидо, д-р Хосе Луис Герреро-Наранхо, QFB Virginia Vanzzini-Zago, Dra. Долорес Риос и Валлес-Валлес, доктор Абелардо Родригес-Рейес. Преподобный Мекс Офтальмол Сентябрь-Октябрь 2002 г .; 76 (5): 178-183
«Публикация о клиническом онкоцеркозе глаза» в Revista Studium Ophthalmologicum.Том XV № 4/1996: 325-329.
«Clasificación mensurada del pterigium». Publicado en la Revista Studium Ophthalmologicum. Том XV №2 / 1996: 135-137.
«Фурункулезный миаз личинки Dematobia hominis en anexos oculares. Reporte de 9 casos ». Publicado en la Revista Studium Ophthalmologicum. Том XV №2 / 1996: 165-169.
CAPITULOS DE LIBROS PUBLICADOS
VIII. CAPITULOS DE LIBROS PUBLICADOS
Луис М. Суарес-Тата, Моравия Б. Суарес-Тата, Рейнальдо Гарсия.Идиофатическое макулярное отверстие Глава 22. Офтальмология: Эн Торрес Сориано М.Э., Гарсия Агирре Дж., Максимилиано Гордон и Вероника Кон Граверсен В. «Офтальмология: текущие и будущие разработки», Bentham Science Publishers. 2016, Т. 1, 235-248.
Гарсия Р.А., Торрес Поррас Е., Аревало Дж. Ф., Муси Мендоса Р., Ория V и Суарес Тата, Луис. Глазной туберкулез. Глава 2. Эн Торрес Сориано М.Э., Гарсия Агирре Дж., Максимилиано Гордон и Вероника Кон Граверсен В. «Офтальмология: текущие и будущие разработки», Bentham Science Publishers.2016, Т. 3, стр. 9-18.
Гарсия Р.А., Аревало Дж. Ф., Муси Мендоса Р., Ория V и Суарес Тата, Луис. Глазной токсокароз. Глава 16. Эн Торрес Сориано М.Э., Гарсия Агирре Дж., Гордон М., Кон Граверсен В. «Офтальмология: текущие и будущие разработки», Bentham Science Publishers. 2016, Т. 3, стр. 117-125.
Диффузный односторонний подострый нейрооретинит при некоторых системных заболеваниях сетчатки и хориоидеи. Компания Springer Verlag. 2-е изд. 2010; Глава 2. Впечатление.Аревало Дж. Ф., Гарсия Р. А., Луис Суарес Тата, Александр де АГ, Фернандо Орефиче, Андре Кури, Эммет Каннигам.
Обновленная информация о симпатической офтальмии. Ближневосточно-африканский офтальмологический журнал (MEAJO). Передовая статья редактора En consideracion comite revisor. Аревало Дж. Ф., Гарсия Р. А., Санчес Дж. Г., Суарес-Тата Л. М..
Последняя информация о симпатической офтальмии. Arevalo JF, Garcia RA, Al-Dhibi HA, Sanchez JG, Suarez-Tata L. Middle East Afr J Ophthalmol. 2012 Янв; 19 (1): 13-21.
Infectología Clínica Pediátrica.Доктор Наполеон Гонсалес Салданья. VII Edición 2006. Capítulo: Celulitis Infecciosas de la Cara. Автор: Д-р Хуан Гвидо Тата Кумана. Соавторы: д-р Суарес Тата, Луис Мигель; Суарес Тата, Моравия.
Retina Diagnóstico y Tratamiento. Уго Кирос Меркадо. Даниэль Очоа Контрерас. Вирджилио Моралес Кантон. Хосе Далма Вайсхаус. Хуан М. Хименес Сьерра. Segunda Edición Capítulo 14: Angiografía de retina y coroides. Хуан М. Хименес Сьерра, Уго Кирос Меркадо, Хосе Луис Герреро, Луис М. Суарес Тата и Серхио Мурильо Лопес.Стр. 105-118. Мак Гроу-Хилл.
Retina Diagnóstico y Tratamiento. Уго Кирос Меркадо. Даниэль Очоа Контрерас. Вирджилио Моралес Кантон. Хосе Далма Вайсхаус. Хуан М. Хименес Сьерра. Segunda Edición Capítulo 15: Tomografía óptica coherente, radiografía, tomografía por computadora y Resonancia Magnética. Хосе Луис Герреро Наранхо, Луис М. Суарес Тата и Даниэль Очоа Контрерас. Стр. 119–127. Мак Гроу-Хилл.
Retina Diagnóstico y Tratamiento. Уго Кирос Меркадо. Даниэль Очоа Контрерас.Вирджилио Моралес Кантон. Хосе Далма Вайсхаус. Хуан М. Хименес Сьерра. Segunda Edición Capítulo 34: Oclusión de rama venosa de la retina. Вирджилио Моралес Кантон и Луис М. Суарес Тата. Pag 339-352. Мак Гроу-Хилл.
Retina Diagnóstico y Tratamiento. Уго Кирос Меркадо. Даниэль Очоа Контрерас. Вирджилио Моралес Кантон. Хосе Далма Вайсхаус. Хуан М. Хименес Сьерра. Segunda Edición Capítulo 36: Oclusiones arteriales de la retina. Хосе Далма Вайсхаус, Габриэла Лопескараса Эрнандес и Луис М.Суарес Тата. Pag 353-365.Mc Graw-Hill.
Retina Diagnóstico y Tratamiento. Уго Кирос Меркадо. Даниэль Очоа Контрерас. Вирджилио Моралес Кантон. Хосе Далма Вайсхаус. Хуан М. Хименес Сьерра. Segunda Edición Capítulo 49: Membranas epirretinianas. Хуан М. Хименес Сьерра, Вирхилио Моралес Кантон и Луис М. Суарес Тата. Pag 467-474. Мак Гроу-Хилл.
Feuerwehrmann Sam Jungen Tatü Tata! Ich bin 4 — синие футболки для детей, Feuerwehrmann Sam
Erfolgreich gespeichert.Wir benachrichtigen Sie bei Wiederverfügbarkeit.
Der Service ist leider im Moment nicht verfügbar. Bitte versuchen Sie es zu einem späteren Zeitpunkt noch einmal. Unser Kundenservice hilft Ihnen gerne weiter.Unser Kundenservice hilft Ihnen gerne weiter. Jetzt Kontakt zu myToys aufnehmen.
Vielen Dank für Ihr Interesse an unserem Newsletter.Bitte bestätigen Sie Ihre Anmeldung über den Link, den wir an Ihre E-Mail-Adresse ‘$ email $’ geschickt haben.
Vielen Dank für Ihr Interesse — Sie erhalten nun auch unseren myToys-Newsletter.
Vielen Dank für Ihr Interesse — Wir senden Ihnen gerne weiterhin unseren MyToys-Newsletter.
Leider ist bei Ihrer Anmeldung zum Newsletter ein Fehler aufgetreten.Bitte wenden Sie sich an unseren Kundendienst.
Wir melden uns gerne, wenn Ihr Wunschprodukt wieder verfügbar ist.
РУБАШКА
Feuerwehrmann Sam Jungen Tatü Tata! Ich bin 4 — синие футболки для детей
Фарбе: dunkelblau
Größe:
Weiter EinkaufenNach 90 Tagen wird der Benachrichtigungsauftrag automatisch gelöscht.