Тнт онлайн передачи: Прямой эфир телеканала ТНТ

Содержание

Канал ТНТ. Смотреть онлайн. Прямой эфир телеканала ТНТ в интернете. ТВ программа канала НТН.

ТВ-канал ТНТ — один из крупнейших развлекательных телеканалов России. Аудитория канала насчитывает сотни миллионов человек. ТНТ — скандально известен телепроектом Дом и Дом-2. На телеканале ТНТ показываются популярные шоу: Битва экстрасенсов , Экстрасенсы ведут расследование, Comedy Club, Наша Russia; программы: Секс с Анфисой Чеховой, Запретная зона, Бремя денег, Окна, Школа ремонта, Необъяснимо, но факт; телесериалы Букины, Универ, Интерны и другие. Вещание ТНТ онлайн в интернете отключено правообладателем телеканала. Просмотреть некоторые программы ТНТ
возможно на телеканале Барс.

ТНТ онлайн прямой эфир официальный сайт

Телеканал ТНТ появился в 1997 году и сразу завоевал своего постоянного зрителя. Твое Новое Телевидение (так расшифровывается аббревиатура) относится к развлекательным телеканалам и занимает пятое место в рейтинге по популярности в России, среди аналогичных каналов. Телеканал, кстати, Федеральный и является частью холдинга Газпрома.

Канал ТНТ

Появившись в 97 году, канал Твое Новое Телевиденье прошел долгий путь до того, как стал таким, каким мы его привыкли видеть. Из информационно-популярного, постепенно сменив формат на развлекательный. Канал стал выделяться из общей массы конкурентов.

Несколько прорывных событий, которые смогли завоевать большую часть телеаудитории:

Создание шоу = «Камеди Клаб»;
Выпуск сериала «Интерны»;
Запуск нескольких молодежных ситкомов;
Выпуск шоу «Наша Раша».

Развиваясь с огромной скоростью, каналу становится «тесно» в собственном эфирном времени. И руководством принимается решение открытие еще нескольких дочерних каналов того же типа, для трансляции своих телепрограмм. Например:

ТНТ4;
ТНТ-Музыка.

Эти каналы, являются тематическими и работают в своем узконаправленном формате. Например, ТНТ4 — круглосуточно транслирует самые популярные шоу и лучшие моменты из них.

А на ТНТ-Музыка — транслируются лучшие музыкальные сцены и выступления из эфира.

Смотреть ТНТ онлайн

Популярность канала росла и растет с каждым годом, и с каждым новым шоу. Каждая передача находит армию собственных поклонников, так как рассчитана в основном на молодое поколение и затрагивает темы, которые волнуют именно эту категорию людей.

Такие программы, как:

Стендап;
Камеди-клаб;
Камеди-вумен;
Открытый микрофон.

Набирают все большую популярность и просмотр их не останавливается на обычном аналоговом вещании.

Телепрограммы канала транслируются несколькими популярными способами: аналоговое вещание, ИП-телевиденье и онлайн трансляции. Прямой эфир в онлайн, можно посмотреть на официальном сайте телеканала. Более того, на сайте можно найти сборник всех телепередач и шоу, в удобном формате. Разбитые на части и сезоны.

Также, на сайте телеканала, можно прочитать обзоры передач, поучаствовать в обсуждениях и оставить свои комментарии.

Некоторые передачи имею возможность выставления оценок и рейтинга.

Удобство возможности просмотра в любом месте и в любое время, позволяет телеканалу не только удерживать уже собранную армию поклонников, но и приобретать все новых и новых.

Смотри русское телевидение онлайн бесплатно. Russian TV online free. Russkoe TV po internetu besplatno

Все представленные здесь каналы БЕСПЛАТНЫ для просмотра
	«РТР-Планета» — круглосуточная телепрограмма на русском языке, специально созданная для русскоязычных соотечественников, проживающих за рубежом, и состоит из лучших телепрограмм каналов «Россия» и «Культура«.
	«Россия 24» (Вести) — Круглосуточный информационный канал
	Первый российский канал (ОРТ)	смотреть
	«Россия 1» — государственный федеральный общественный канал
	«НТВ» — одна их ведущих и самых популярных российских телекомпаний.

	«Мир 24» — круглосуточный информационный телеканал о событиях, происходящих как на территории стран содружества (СНГ), так и во всем мире.	смотреть
	«Россия К» — о мировой и отечественной культуре	смотреть
	EuroNews на русском	смотреть
	«СТС» — одна из крупнейших коммерческих телевещательных компаний в России. Позиционирует себя как «первый развлекательный канал».	смотерть
	Канал «ТНТ» — лучшие игровые и документальные фильмы, публицистические, детские, спортивные…
	Канал «Матч ТВ» (бывший «Россия 2») — спортивный канал. Новости спорта и прямые трансляции с игр, соревнований и олимпиад.	смотреть
	«Рен ТВ» (Ren TV). Один из самых популярных российских телеканалов, в сетке вещания которого отечественные и зарубежные фильмы, сериалы
	«Наука 2. 0» — научно-популярный телеканал о достижениях российской и мировой науки и новых технологиях.	смотреть
	«Че» — телеканал про настоящих мужчин	смотреть
	«Пятый канал» — Один из ведущих и популярных российских федеральных телеканалов, транслирующий из Санкт-Петербурга.	смотреть
	«ТВ Центр» — одна из ведущих российских телекомпаний.	смотреть
	«МИР» — Телевидение стран содружества СНГ. Новости, общественно-политические и развлекательные передачи, фильмы, сериалы как стран содружества так и зарубежные.
	«Звезда» — телеканал, посвященный защите Отечества	смотреть
	«Москва 24» — круглосуточный информационный телеканал о жизни столицы.	смотреть
	Общественное телевидение России (ОТР)	смотреть
	«ТВ3» — федеральный телеканал, специализирующийся на фантастике, мистике и приключениях.	смотреть
	«Домашний» — российский телеканал, ориентированный на семейный просмотр.	смотреть
	«Пятница» — телеканал позитива, хорошего настроения и веселых путешествий.	смотреть
	РБК Первое Российское бизнес-телевидение
	Телеканал «Дождь ТВ«	смотреть
	«Просвещение» — Национальный образовательный телевизионный канал	смотреть
	«Шансон ТВ»	смотреть
	«Беларусь ТВ» Белорусский государственный телерадиоканал
	Белcат ТВ — о реальной ситуации в Беларуси !!!	смотреть
	«Первый канал» Белорусского государственного телевидения.	смотреть
	«Первый канал Евразия» — русскоязычный казахстанский телеканал на базе российского «Первого канала».	смотреть
	Канал «Настоящее Время» освещает события и темы, которые волнуют людей на постсоветском пространстве. Канал рассказывает о том, что обходят стороной официальные СМИ	смотреть

	«Интер» — общенациональный украинский телеканал	смотреть

ТНТ онлайн, прямой эфир в реальном времени

Каждый день прямой эфир телеканала ТНТ радует какими-то новыми событиями и при этом уже давно прерогативой вещания являются развлекательные и познавательные программы, передачи, телешоу, фильмы и сериалы. И никакой политики – разве что в остроумных шутках резидентов Камеди Клаба. И никаких криминальных новостей – разве что в очередном остросюжетном и интересном блокбастере, который Вы можете посмотреть на телеканале ТНТ в хорошем качестве бесплатно. Фильмам здесь уделяется особенное внимание, поскольку мы то помним, что именно является важнейшим из искусств. И на этом телеканале не демонстрируются заведомо провальные и неинтересные малобюджетные фильмы, которые нужны разве что для заполнения эфира. Но ТНТ есть, что показывать! Потому зрители все больше и чаще спешат смотреть ТНТ. Только самое интересное, потрясающее и незабываемое. Если это голливудское кино, то из тех, которые собирали большие кассы и о которых много говорили в прессе. Если это сериал, но самый свежий, захватывающий и – главное! – зачастую собственного производства.

Действительно немногие телеканалы в России могут себе позволить производство высококачественных, интересных и увлекательных сериалов. ТНТ – один из немногих и, как признано, лучший телеканала в этом плане. Сериалы, произведенные под руководством этого канала и демонстрировавшиеся (и демонстрирующиеся!) впервые на ТНТ не первый год признаются лучшими отечественными сериалами – Интерны, Универ, Реальные Пацаны…Да вы сами знаете и любите героев этих многосерийных фильмов, уже ставшими народными любимчиками и любимицами. А любимые передачи — Холостяк ТНТ, Дом 2, Камеди Клаб…Разве можно представить сегодняшнее телевиденье без этих рейтинговых супер передач и телешоу!

Ведь это с подачи ТНТ появился такой сериал, как Интерны, который демонстрируется уже не первый год и не первый год уже признаете лучшим из лучших. Люди полюбили его героев – доктора Быкова, его интернов Лобанова, Романенко, Черноус, Ричардса, Левина, гинеколога Купитмана, красавицу Любу и заведующую поликлиникой Кисегач. Это ведь фразы доктора Быкова в исполнении неподражаемого Ивана Охлобыстина стали народным достоянием и практически народными цитатами. Это с подачи доктора Купитмана, героя талантливого артиста Вадима Демчога, люди теперь с улыбками щураться на всех гинекологов. Авторам проекта удалось практически убедить зрителя в том, что каждый из героев этого сериала существует в действительности, а многим актерам этот фильм дал настоящую путевку в жизнь и стал отличным плацдармом для взлета дальнейшей успешной актерской карьеры. Все это можно смотреть в прямом эфире и радоваться тем возможностям, которые предоставляет российский супер канал ТНТ.

Вы можете включить ТНТ утром, и Вам точно будет, что посмотреть. Включите этот телеканал в полдень – например, когда Вы пришли с работы на обеденный перерыв – и Вы с трудом оторветесь от экрана. В конце концов, включите телеканал ТНТ вечером и Вы наверняка не пожалеете, что провели время в такой чудесной и неповторимой компании! Любое время суток телевиденье готово ублажать своего телезрителя и отвечать на все его запросы и требования. Поэтому ТНТ онлайн смотреть весело, познавательно и увлекательно одновременно!

А по праздникам телеканал ТНТ обыкновенно дарит собственным телезрителям множество телевизионных подарков! Любимые телешоу в праздничном формате, а также в формате «все самое лучшее», любимые сериалы – причем, сразу по несколько серий подряд! Не удивительно, что к многочисленной армии поклонников этого телеканала на праздники прибавляется еще большое количество людей. Люди ищут, чем себя развлечь. Люди устали от криминальных новостей и политических скандалов и людям больше не нужны псевдоаналитические программы на «умных» каналах, в которых переливают «из пустого в порожнее». Зрители требуют зрелища, и телеканал ТНТ дает им самое лучшее из зрелищ! И главное, что Вы имеете возможность смотреть телеканал ТНТ бесплатно – это обозначает, что удовольствие становится еще круче и более незабываемо. До существования такого телеканала можно было только мечтать о каждом веселом вечере, который обеспечивало бы телевиденье. Сегодня у Вас есть прекрасная возможность окунуться в мир телевиденья двадцать первого века и по достоинству оценить его.

Прямой эфир ТНТ онлайн — Смотреть трансляцию канала ТНТ в HD 720 бесплатно

«ТНТ» не случайно является одним из самых популярных и оригинальных телеканалов в эфирном пространстве нашей страны. Ежегодно коллекция канала пополняется новыми реалити-шоу, документальными и художественными фильмами, телепередачами, мультипликационными и телевизионными сериалами.

Основой эфира является ни на что не похожий контент. Наверняка это и есть одна из причин, объясняющих высокую популярность телеканала у молодежи.

Немного исторических справок

Эфирное вещание «ТНТ» датировано самым началом 1998 года и первым успешным проектом стал телесериал «Улицы разбитых фонарей». После у канала заказывают новый остросюжетный сериал под названием «Агент национальной безопасности». Именно на телеканале «ТНТ» зажигается звезда популярного ныне ведущего Дмитрия Нагиева.

Начиная с лета 2002 года, на телеканале запускают абсолютно новый проект «Дом», а в следующем году стартует показ сериала «Саша+Маша», ставшего одним из самых успешных телесериалов в истории «ТНТ». В том же году стартует реалити-шоу «Дом-2», которое спокойно существует и поныне.

Современные лица ТНТ

За всю, еще не закончившуюся историю телеканала, на нем было показано огромное количество проектов собственного производства. Сегодня многие из них до сих пор востребованы зрителями и идут в повторе. К слову, именно благодаря «ТНТ» страна узнала, кто такая ныне популярная Ксения Собчак.

На сегодняшний день самыми популярными шоу на канале являются «Дом-2», «Comedy Club», «Битва экстрасенсов» и «Танцы со звездами». Среди телевизионных сериалов особо востребованы «Интерны», «Реальные пацаны», «Деффчонки». На данный момент идет кропотливая работа над выходом третьего сезона телепроекта «Остров».

В целях максимально приблизиться к народу «ТНТ» регулярно меняет свои рекламные заставки, корректирует сетку телевещания. Именно этот канал стал одним из первейших, которые оказались полностью независимыми от факторов внешней экономики. Политических шоу на канале также не существует, что, собственно, и привлекает в нем не только молодых людей, но и граждан более старшего возраста.

Смотрите телеканал «ТНТ» на нашем сайте, улыбайтесь, расслабляйтесь, окунувшись в другую, более мягкую и приятную реальность!

Канал ТНТ-онлайн

Когда бы вы любите программы и телепроекты канала ТНТ, но не всегда успеваете ориентироваться любимые передачи по телевизору, теперь у вас есть альтернатива — канал тнт онлайн! Заходите на канал tnt-premier. ru, и вы всегда сможете посмотреть новые серии и выпуски телепрограмм в хорошем качестве в какими судьбами придется удобное для вас время.

Достоинства проекта tnt-premier.ru

Целевая аудитория канала ТНТ — это молодёжь, которая любит искромётный юмор, увлекательные сериалы и захватывающие реалити-шоу. Близко ((тому) как) известно, молодые люди редко смотрят телевизор, зато много времени проводят в интернете. В таком случае-то и есть поэтому онлайн-трансляции широко востребованы у современных молодых людей. Водная магистраль tnt-premier.ru обладает целым рядом преимуществ для пользователей:

наличие всех программ, реалити-телешоу и сериалов;
высокое колорит трансляций;
высокая скорость трафика;
чёткий каталог, где распределены безвыездно передачи по мнению категориям;
возможность оставлять комментарии, обмениваться своими мнениями о программах;

Благо вы любите насмешка, увлекательные сериалы и интригующие реалити-шоу, но не веков) успеваете смотреть домашний экран, заходите на канал ТНТ-онлайн, где ваша милость найдёте все интересующие вы программы. Здесь доступны как онлайн-трансляции, (до и записи программ, и вы можете выкроить — либо смотреть телепрограмму в режиме реального времени, либо отложить на черный день просмотр на вслед за (тем, посмотрев запись. Смотрите и пересматривайте любимые фильмы и программы с вашими любимыми телеведущими в хорошем качестве — в (заправский у вас есть такая возможность! Помимо этого, канал проводит различные акции, в частности, раздаёт промокоды своим пользователям получи и распишись бесплатное скачивание сериалов. Если у вас жрать промокод, вы вводите его в специальное окно и можете скачать нужный вам мыльная опера или выпуск программы.

Чтобы испокон (веку иметь доступ к телепроектам ТНТ, заведите неординарный аккаунт на канале. Регистрация нате сайте занимает всего несколько минут, и ваша сестра можете пользоваться всеми опциями канала.

Направить аккаунт на ТНТ-онлайн

Благо вас заинтересовали программы ТНТ-онлайн, вас можете зайти на сайт, захлопнуть свой аккаунт, введя логин, пароль и личные исходняк для регистрации. Аккаунт активируется за ссылке, которую вам пришлёт администрация сайта нате электронную почту. Заходите самочки и приглашайте друзей — любителей телеканала ТНТ для совместного просмотра телепроектов, весёлого времяпрепровождения и обмена мнениями. Вы можете поделиться ссылкой на канал в соцсетях, чтобы приглашать друзей и всех желающих подсоединиться.

Плюсы просмотра ТНТ-канала с прямыми эфирами

ТНТ является одним из самых популярных каналов. Современный человек уже давно имеет особое пристрастие к телевещанию.

Телеканалы имеют разную направленность и нацелены на определенную аудиторию. В бешеном ритме жизни человек постоянно вынужден решать какие-то проблемы, именно поэтому особенным спросом пользуются различные развлекательные передачи и легкие фильмы. Благодаря им на время можно забыть о личных проблемах и отдохнуть от привычного мира. ТНТ является развлекательным каналом. Для многих тнт онлайн прямой эфир (16+) которого транслируется на специализированном сайте является самым любимым телеканалом.

Особенности выбора

Поэтому так важно, чтобы просмотр был максимально комфортабельным – без перебоев связи, без прерываний на Интернет-рекламу или подобных ситуаций, которые только могут разнервировать человека. Следует учесть, что на специализированном сайте в дополнительном порядке возможно посмотреть еще и программу передач, чтобы точно знать, когда и что будет идти (речь идет про передачи, фильмы, сериалы и т.п.).

Канал транслирует различные развлекательные программы. Благодаря высокоскоростному интернету при желании любой пользователь может просматривать ТНТ-онлайн. Пользователь сможет смотреть любимые передачи не только в режиме реального времени, но и просматривать любые выпуски необходимых передач. для этого достаточно иметь устройство с доступом в интернет и зайти на сайт ТНТ-онлайн.

Преимущества ТНТ-онлайн

Среди них можно выделить такие:

удобный интерфейс. Любой пользователь сможет разобраться достаточно быстро;
поисковая система позволяет пользователям найти необходимую передачу. Также можно ориентироваться на дату эфира;
в одном месте собраны выпуски всех любым передач;
при желании можно выбрать любимую передачу или уточнить время трансляции;
на сайте можно ознакомиться с последними новостями.

Смотреть ТНТ-онлайн можно без ограничений в любом месте Земного шара, достаточно лишь иметь устройство с доступом в интернет. К тому же разработчики постоянно стараются улучшить сайт для более удобного пользования. Ежедневно ТНТ-онлайн просматривают миллионы людей в максимально удобное для себя время.

кандидатов Время и канал передачи в Перу Где увидеть конец Мисс Вселенная 2021 TNT Telemundo Univisión Canal RCN и Azteca Uno

Мисс Вселенная 2021 транслируется LIVE сегодня, 16 мая, в Hard Rock Hotel & Casino Hollywood во Флориде, США Состояния. Всего 74 кандидата, в том числе Мисс Перу 2020 Яник Масета, будут бороться за корону и титул Мисс Вселенная .

Отобранные участники выйдут на сцену, демонстрируя лучшее из своих личностей и харизмы.Только одна из них будет носить корону как следующая королева красоты.

В Латинской Америке трансляцию мероприятия, в рамках которого будет представлено музыкальное шоу Луиса Фонси, можно будет увидеть по сигналу TNT , Telemundo, Univisión, Canal RCN и Azteca Uno.

Яник Масета, перуанский кандидат, попадает в Топ-21

Перуанский участник вошел в Топ-21 и является не единственным выбранным латиноамериканцем, но есть также представители Колумбии, Мексики и Аргентины.

Стартовал «Мисс Вселенная 2021»

Стартовал 69-й конкурс красоты «Мисс Вселенная 2021». Представители каждой страны завораживают своими красочными нарядами от Seminole Hard Rock Hotel & Casino, расположенного в Голливуде, штат Флорида (США).

ПРЕДЫДУЩАЯ ЗАПИСКА

Когда состоится Мисс Вселенная 2021?

miss Universe Он прибывает в своем 69-м выпуске в это воскресенье, 16 мая 2021 года. Организация проведет специальный конкурс после того, как он был отложен из-за пандемии коронавируса.

Во сколько транслируется «Мисс Вселенная 2021»?

Мисс Вселенная 2021 Его можно будет увидеть в это воскресенье, 16 мая, в 19:00 (время Перу) по сигналам TNT, Telemundo, Univisión, Canal RCN и Azteca Uno.

Какие каналы будут транслировать «Мисс Вселенная 2021»?

Редактирование Мисс Вселенная 2021 Его можно увидеть на основных международных каналах событий, таких как TNT, Telemundo, Univisión, Canal RCN и Azteca Uno.

Кто выигрывал последнюю мисс Вселенную?

Южноафриканская Зозибини Тунзи — нынешняя королева красоты.Он правит дольше всех на сегодняшний день. В это воскресенье 16 узнает, кто станет его преемником.

Кто будет представлять Перу в Мисс Вселенная 2021?

Яник Масета, избранная Мисс Перу 2020, будет представлять страну в 69-м конкурсе Мисс Вселенная.

Мисс Вселенная 2021: Кто такой Яник Масета, ФОТО Перуанского кандидата конкурса красоты

Мисс Вселенная 2021: участницы от каждой страны:

Албания — Паула Мехметукай
Аргентина — Алина Луз Аксельрад
Армения — Моника Григорян
Аруба — Хелен Эрнандес
Австралия — Мария Таттил
Багамы — Шаунта Миллер
Барбадос — Хиллари-Энн Уильямс
Бельгия — Ковен Дения
Белиз — Ирис Сальгеро
Боливия — Ленка Немер
Бразилия — Бразилия — Ленка Немер
Бразилия — Гама
Британские Виргинские острова — Шабри Фретт
Болгария — Радинела Чушева
Камбоджа — Сарита Рет
Камерун — Косинда Анджеле
Канада — Нова Стивенс
Каймановы острова — Мэрайя Тиббетс
Чили — Даниэла Николас — Китай Джаксин Сан
Колумбия — Лаура Виктория Оласкуага
Коста-Рика — Ивонн Сердас
Хорватия — Мирна Найя Марич
Кюрасао — Шанталь Виертц
Чешская Республика — Клара Ваврушкова
Дания — Аманда Петри
Доминиканская Республика — Кимберли Хименес
Эквадор — Лейла Сальваче Велеса
— Ванесса Эспиноза
Финляндия — Вийви Альтонен
Франция — Амандин Пети
Гана — Челси Тайуи
Соединенное Королевство — Жанетт Акуа
Гаити — Иден Берандуив
Гондурас — Сесилия Росселл
Исландия — Элизабет Хульдар Сноррадин
— Индия — Элизабет Хулдар Сноррадот
Индонезия — Аю Маулида Путри
Ирландия — Надия Сэйерс
Израиль — Техила Леви
Италия — Вивиана Виццини
Ямайка — Микеал-Симон Уильямс
Япония — Айша Харуми Точиги
Казахстан-Камила Серикбай
Южная Корея — Хари Парк
Косово — Блерта Весели
Лаос — Кристина Ласасимма
Малайзия — Франциска Лухонг Джеймс
Мальта — Антея Заммит
Маврикий — Вандана Джита
Мексика — Андреа Меза
Бирма — Тузар Винт Лвин
Непал — Аншика Шарма
Никарагуа — Ана Марсело
Норвегия — Суннива Фригстад
Панама — Кармен Харамильо
Парагвай — Ванесса Кастро Гильен
Перу — Яник Масета Дель Кастильо
Филиппины — Рабия Матео
Польша — Рабия Матео
Польша Кристиана Сильва
Пуэрто-Рико — Эстефания Сото
Румыния — Бьянка Лорена Тирсин
Россия — Алина Санко
Сингапур — Бернадетт Бель Онг
Словакия — Наталия Хоштакова
Южная Африка — Наташа Жуберт
Испания — Андреас
Таиланд — Аманда Обдам
Украина — Елиз aveta Yastremska
Уругвай — Лола-де-лос-Сантос
США — Филиал Asya
Венесуэла — Mariángel Villasmil
Вьетнам — Nguyễn Trần Khánh Vân

Оживите презентацию Яника Масеты в типичном костюме:

Мисс Вселенная 2021 была одета в типичный костюм, вдохновленный перуанским фламенко.

Дизайн был разработан Бето Пинедо.

Как проголосовать за Мисс Перу?

Чтобы поддержать Janick Flowerpot , перуанского кандидата в Мисс Вселенная 2021, вам просто нужно выполнить следующие шаги:

Загрузите официальное приложение «Мисс Вселенная» по этой ССЫЛКЕ
Войдите на вкладку делегатов
Посмотрите за вариант Мисс Вселенная Перу
Перейдите на вкладку , проголосуйте за Перу, сейчас и готово.

Директор «Мисс Вселенная» отправляет сообщение перуанцам

Пула Шугарт подчеркнула поддержку, которую все перуанцы оказали представительнице «Мисс Вселенная» Яник Цветочный горшок . Также директор конкурса задумался о пандемии.

«Я люблю фанатов (Перу), и мне нравится, насколько они поддержали. Будьте в безопасности, используйте маски, пожалуйста. Мы почти вышли из этой пандемии, мы должны работать вместе. Спасибо, — сказал он.

Мисс Вселенная, последние новости:

Информационный бюллетень LR Shows

Подпишитесь на информационный бюллетень Espectáculos La República и получайте с понедельника по субботу по электронной почте самые важные новости национальных и международных развлечений, а также актуальные темы в социальных сетях.

9000 2.

Что такое ТНТ? Как смотреть игры «Мартовское безумие 2021 года» на DirecTV, Dish и др.

TNT известен тем, что показывает баскетбол, но обычно это больше профессионального уровня. Но во время турнира «Мартовское безумие NCAA» TNT продемонстрирует некоторые действия турнира NCAA. В результате те, кто не смотрит профессиональный баскетбол или какие-либо программы TNT, могут задаться вопросом: «Что такое TNT?»

Sporting News здесь, чтобы помочь в этом, так как у нас есть справочник каналов для TNT, независимо от того, какое кабельное телевидение у вас есть.И резаки для шнура, не отчаивайтесь: есть также множество способов транслировать игры TNT для тех, у кого нет традиционных пакетов кабельного телевидения.

Вот вся необходимая информация о TNT, в том числе, какие игры будут на станции, когда они и многое другое.

БОЛЬШЕ МАРТОВОГО БЕЗУМИЯ: телепрограмма | Кронштейн для печати | Шансы

Какой канал ТНТ?

Поскольку в турнире NCAA 67 игр, ни одна сеть не может транслировать все игры. Таким образом, подразделение Turner Sports WarnerMedia использует TNT, TBS и truTV, чтобы помочь CBS в освещении мартовского безумия. У TNT будет возможность транслировать 12 из 43 игр, выделенных для этой группы, в то время как TBS будет транслировать 20, а TruTV получит 11. CBS будет транслировать оставшиеся 24 игры.

Игры турнира NCAA на TNT

TNT будет транслировать 12 игр во время турнира NCAA. Они не вступят в игру до 1-го раунда — так как TBS и truTV будут вести первые четыре игры, — но после этого они транслируют 12 игр в 1-м и 2-м раундах турнира.

Ниже представлена разбивка игр TNT за раунд:

Раунд 1: Восемь игр
Раунд 2: Четыре игры

А вот ТВ-расписание для каждой игры TBS:

Раунд 1

Пятница, 19 марта

Игра	Время	телевизор
Штат Юта № 11 против Техасского технологического института № 6	1:30 с. м.	TNT
№ 12 Штат Орегон против № 4 Теннесси	16:20	TNT
№ 13 Северный Техас против № 4 Purdue	19:15	TNT
№ 12 Винтроп против № 5 Вилланова	21:50	TNT

Суббота, 20 марта

Игра	Время	телевизор
№9 St. Bonaventure vs. No. 8 LSU	13:30	TNT
No. 11 Wichita State / Drake vs. No. 6 USC	16:20	TNT
№ 9 Миссури против № 8 Оклахома	19:15	TNT
VCU № 10 по сравнению с Oregon № 7	21:50	TNT

Раунд 2

Воскресенье, 21 марта

Игра	Время	телевизор
№6 Техасский Технологический институт против № 3 Арканзас	18:00	TNT
№ 13 Северный Техас против № 5 Вилланова	8:30 вечера	TNT

Понедельник, 22 марта

Игра	Время	телевизор
№ 13 Огайо против № 5 Крейтон	18:00	TNT
№ 10 Мэриленд vs. № 2 Алабама	8:30 вечера	TNT

Как транслировать игры March Madness бесплатно онлайн

Cord-cutters могут легко транслировать March Madness онлайн через NCAA March Madness Live. Другие варианты включают fuboTV (который предлагает семидневную бесплатную пробную версию) и несколько других специализированных потоковых сайтов.

Ниже приведено полное изложение ( не каждый вариант включает каналы Turner Sports) :

Мартовское безумие технически начинается с первых четырех игр в четверг, 18 марта, которые определят финальное поле из 64 команд.Собственно мартовское безумие начинается с 1-го раунда в пятницу, 19 марта. Он завершается Финалом четырех и играми национального чемпионата 3 и 5 апреля соответственно.

Круглый	Даты
Первые четыре	18 марта
Раунд 1	19-20 марта
Раунд 2	21-22 марта
Сладкий 16	27-28 марта
Элитная восьмерка	29-30 марта
Финал четырех	3 апреля
Чемпионат страны	5 апреля

Смотрите игры на ABC, ESPN, TNT без кабеля

Национальная баскетбольная лига возобновила сезон 2019-2020 в начале этой недели в попытке спасти то, что осталось после того, как COVID-19 нарушил большинство профессиональных видов спорта. Полный список игр НБА состоится сегодня (воскресенье, 2 августа) и в течение следующих нескольких дней. Лига собирает как можно больше игроков до того, как через две недели начнется плей-офф НБА. Сегодняшний состав:

14:00. ET : Вашингтон Уизардс против Бруклин Нетс (Да, NBC Sports Washington)
15:30 ET : Портленд Трэйл Блэйзерс против Бостон Селтикс (национальный ABC, NBC Sports Boston, NBC Sports Northeast)
16:00 ET : Сан-Антонио Спёрс против Мемфис Гриззлис (Fox Sports Southeast-Memphis, Fox Sports Southeast-San Antonio)
6 стр.м. ET : Сакраменто Кингз против Орландо Мэджик (NBA TV, Fox Sports Florida, NBC Sports California)
20:30 ET : Милуоки Бакс против Хьюстон Рокетс (ABC National, AT&T SportsNet, Fox Sports Wisconsin, SN1)
21:00 ET : Dallas Mavericks против Phoenix Suns (Fox Sports Arizona, Fox Sports Southwest-Dallas)

Все игры пройдут в пределах защитной зоны «пузыря» НБА в Орландо. Как видно из сегодняшнего состава, игры транслируются по множеству каналов.Основные телеканалы, в которых проходят матчи НБА регулярного сезона:

. Вы можете ознакомиться с полным расписанием телепрограмм НБА здесь. (Предупреждение: это немного запутано.)

Если вы хотите транслировать игры НБА на свой компьютер, телефон или смарт-телевизор, и у вас нет регулярной подписки на кабельное телевидение, есть несколько способов сделать это. Ниже я собрал несколько вариантов:

NBA TV : это многоуровневая служба подписки, которая дает вам доступ к живым играм. Найдите здесь.
FuboTV : Эта платная услуга предлагает ESPN и ABC, но недавно отказалась от TNT. Найдите здесь.
Hulu With Live TV : Эта платная услуга включает ABC, TBS и ESPN. Найдите здесь.
YouTube TV : Эта платная прямая трансляция от YouTube включает ABC, TBS и ESPN. Найдите здесь.
Sling TV : Эта платная услуга от Dish Network предлагает множество вариантов для игр NBA. Подробности здесь.
AT&T TV Now : Эта платная услуга включает ABC, TBS и ESPN.Найдите здесь.
Locast : Эта бесплатная некоммерческая служба — отличный способ для потоковой передачи вещательных сетей в некоторых городах. Любая из игр, транслируемых на национальном канале ABC, должна быть доступна. Найдите здесь.

Для большинства услуг по подписке вы можете получить бесплатную семидневную пробную версию, и их легко отменить, если они вам не понравятся. Как всегда, проверьте свой почтовый индекс до того, как вы подпишетесь на потоковую службу , чтобы точно узнать, что доступно в вашем регионе.Удачи!

Free HD, River Plate vs. Racing смотрите в прямом эфире через ESPN: телесигнал ONLINE трансляция Прямо сейчас FOX Sports Premium TNT на стадионе Мадре-де-Ситис для финала Суперкубка Аргентины

Посмотрите здесь, River Plate vs. Racing Club через ESPN LIVE : полностью измерены ONLINE Инциденты телевизионного сигнала FOX Sports Premium на стадионе Madre de Cities TNT в Сантьяго-дель-Эстерио LIVE сейчас на аргентинском Super Чашка. Столкновение запланировано на 20:10 по перуанскому времени и 22:10 по аргентинскому времени.

River Plate vs. Racing Club: подтвержденные составы

Ривер Плейт: Армани; Каско, Рохас, Диас, Ангилери; Перес, Мартинес, Де ла Крус; Карраскаль, Борре и Суарес.

Гоночный клуб: Ариас; Ф. Домингес, Сигали, Новильо, Мельгареджо; Миранда, Н. Домингес, Рохас, Рениеро; Чанкалай и Копетти.

Ривер Плейт против Racing Club LIVE: поминутная передача

ПРЕДЫДУЩИЙ

River Plate встретится с Racing Club в этот четверг в Суперкубке Аргентины , финале, который должен был состояться в 2020 году, но был отложен из-за пандемии коронавируса.

Марсело Галлардо, самый успешный тренер в истории «Миллионера», будет добиваться своего 12-го титула, а Хуан Антонио Пицци, вступивший в должность в январе и еще не выигравший, попытается поднять свой первый трофей с «Академией». .

Racing оспаривает Суперкубок за победу в Суперлиге Аргентины 2018/2019 и Ривер за то, что он стал чемпионом Кубка Аргентины 2019 года.

«Милло» не сможет рассчитывать на двух стартовавших в этом матче: правого защитника Гонсало Монтьеля, отсутствующего из-за мононуклеоза, и защитника и капитана Хавьера Пинола , у которого сломано правое предплечье.Кроме того, колумбийский нападающий Рафаэль Сантос Борре получил дискомфорт в правом гребне подвздошной кости и вызывает сомнения.

Джонатан Майдана, который вернулся в клуб на этом проходящем рынке после игры за Толуку, — вариант, который анализировал тренер, а не Пинола. Точно так же, если Борре не выздоровеет, у Хулиана Альвареса больше шансов наверстать упущенное.

Со своей стороны, с тех пор, как Пицци стал тренером гоночного клуба, «Академия» не выиграла. Две ничьи и одно поражение помещают их на одиннадцатое место (из 13 команд) в зоне A Кубка профессиональной футбольной лиги .

Вратарь Габриэль Ариас в это воскресенье в матче с «Эстудиантес де ла Плата» получил «травму правого берега», которая вынудила его покинуть поле. Он сомневается, и если он не поправится, его место займет Гастон Гомес.

Кроме того, у стартового защитника Лукаса Орбана положительный результат на коронавирус, и он будет недоступен. Другой зараженный — чилийский полузащитник Марсело Диас, который восстанавливается после травмы.

ЧИЛЕВИСИОН Чили vs.Бразилия смотрите в прямом эфире через TNT Sports с Неймаром: смотрите ONLINE TV о квалификации Катара 2022 года в прямом эфире События Movistar на стадионе Monumental до 9 даты южноамериканской квалификации

Все подробности, Чили против Бразилия В РЕЖИМЕ ОНЛАЙН через TNT Sports Stadium: смотрите игру Movistar Events, трансляция Chilevisión В прямом эфире сегодня инциденты с Estadio Monumental de Santiago подтвердили составы на дату 9 из Квалификация Катар 2022 . Он идет в 21:00 в Чили и в 20:00 по перуанскому времени.

Эта великая игра введите сюда Выбор Чили и Бразилия , непобежденный в чемпионате мира, будет транслироваться по сигналам Movistar Eventos, Chilevisión и Estadio TNT Sports.

Чили — Бразилия: подтвержденные составы

Чили: Браво; Исла, Марипан, Медель, Диас; Мена, Видал, Пульгар, Арангуис; Моралес и Варгас.

Бразилия: Вевертон; Данило, Эдер Милитао, Маркиньос, Алекс Сандро; Каземиро, Бруно Гимарайнш, Лукас Пакета; Винисиус Младший, Неймар и Габигол.

Чили против Бразилии: ТРАНСМИССИЯ поминутно

Ученики тренера Чили , Мартин Ласарте, в предстоящих матчах многое поставлено на карту: после «Канаринхи» пора сыграть с Колумбией и Эквадором в качестве гостей, ключевые игры, если они хотят выйти с седьмого места, они в настоящее время занимают карту Южной Америки и увеличивают свои возможности для классификации.

Чили против Бразилии: расписания в мире

Перу: 20:00

Эквадор: 8:00 с.м.

Колумбия: 20:00

Мексика: 20:00

Аргентина: 22:00

Чили: 21:00

США (Флорида): 21:00

ПРЕДЫДУЩИЙ

И дело в том, что осталось 11 игр, чтобы определить, какие страны встретятся на чемпионате мира, и на сегодняшний день «Ла Роха» набирает только шесть очков за такое же количество матчей, считая для себя единственную победу над Перу 2. -0 к концу 2020 года.

Но помимо сложностей, Ласарте цепляется за веху, которую они надеются повторить: последнее поражение, которое бразильская команда потерпела в квалификационных матчах, было именно против ее соперника на дежурстве в октябре 2015 года со счетом 2: 0 с голами Эдуардо Варгаса и Алексис Санчес.

Идея, указывают они чилийской командой, состоит в том, чтобы повторить подвиг и побить идеальный результат вердеамарелы, которая набирает 18 положительных результатов в шести сыгранных поединках, за которыми следует 12 очков ее аргентинского защитника.

Его игровые возможности могли повторить то, что было сделано на Кубке Америки, где, хотя Чили выбыл из игры Бразилия В четвертьфинале местным жителям было сложно играть и они забили только после впечатляющей передачи 10-го номера, Неймара. .

Бразилия , со своей стороны, он потерял референтов Эдерсона и Габриэля Хесуса из Манчестер Сити; Алиссон и Фабиньо из Ливерпуля; их капитан Тьяго Силва из Челси; Фред из «Манчестер Юнайтед», Рапинья из Лидса; и Ричарлисон из Эвертона.

У тренера Аденора Леонардо Бакки «Тите», в любом случае, есть скамейка запасных: среди имен на замену были Винисиус-младший, нападающий «Реала»; и товарищ по команде Эдуардо Варгаса по Атлетико Минейро, Халк.

Отсутствие Роберто Фирмино, Ричарлисона и Габриэля Хесуса, постоянных обладателей команды во главе с Тите, делает Халка одним из фаворитов, которые будут сопровождать Неймара в атаке национальной команды в Сантьяго.

Где посмотреть по телевидению Чили против Бразилии?

Вы видите это на экранах Movistar Eventos, Chilevisión и Estadio TNT Sports. (EFE)

НАШ ПОДКАСТ

Эффективна ли вакцина Johnson & Johnson против варианта Дельта?

Согласно последнему исследованию, эта вакцина показала бы свою эффективность в борьбе с тяжелыми заболеваниями и смертью от коронавируса. Доктор Элмер Уэрта подробно рассказывает о характеристиках этой вакцины.

Ингибирование образования туннельных нанотрубок (TNT) и передачи вируса Т-клеточного лейкоза человека типа 1 (HTLV-1) с помощью цитарабина

, ^1, ², ², ², ², ^2, ³, ², ^1, ⁴, ² и ^1, ⁴

Мария Омсланд

¹ Центр биомаркеров рака (CCBIO) Исследовательская группа, Департамент клинических наук, Университет Бергена, Берген, Норвегия

² Секция моделей животных и ретровирусных вакцин, Отделение вакцин, Национальный институт рака, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США

Cynthia Pise-Masison

Дай Фуджикава

² Anim al. Секция моделей и ретровирусных вакцин, Отделение вакцин, Национальный институт рака, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США

Вероника Галли

² Секция моделей животных и ретровирусных вакцин, Отделение вакцин, Национальный институт рака, Национальные институты здравоохранения , Bethesda, Maryland USA

Claudio Fenizia

² Отделение моделей животных и ретровирусных вакцин, Отделение вакцин, Национальный институт рака, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд, США

³ Отдел патофизиологии и трансплантации, Университет Милан, Милан, Италия

Робин Вашингтон Паркс

² Отделение моделей животных и ретровирусных вакцин, Отделение вакцин, Национальный институт рака, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США

Бьорн Тор Гьертсен

¹ Center for Биомаркеры рака (CCBIO), Исследовательская группа точной онкологии, Департамент клинических наук, Университет Бергена, Берген, Норвегия

⁴ Отделение внутренней медицины, Университетская больница Хаукеланд, Берген, Норвегия

Genoveffa Franchini

² Отделение моделей животных и ретровирусных вакцин, Отделение вакцин Национального отдела рака Институт, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США

Вибеке Андресен

¹ Центр биомаркеров рака (CCBIO), Исследовательская группа точной онкологии, Департамент клинических наук, Бергенский университет, Берген, Норвегия

⁴ Отделение внутренней медицины, Университетская больница Хаукеланд, Берген, Норвегия

¹ Центр биомаркеров рака (CCBIO), Исследовательская группа точной онкологии, Отдел клинических наук, Университет Бергена, Берген, Норвегия

² Модели животных и Секция ретровирусных вакцин, Отделение вакцин, Национальный институт рака, Национальный институт s of Health, Бетесда, Мэриленд, США

³ Отделение патофизиологии и трансплантации, Миланский университет, Милан, Италия

⁴ Отделение внутренней медицины, Университетская больница Хаукеланд, Берген, Норвегия

Автор, отвечающий за переписку.

Поступило 19.04.2018 г .; Принято 4 июля 2018 г. Автор (ы) и источник предоставляют ссылку на лицензию Creative Commons и указывают, были ли внесены изменения. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons, если иное не указано в кредитной линии для материала.Если материал не включен в лицензию Creative Commons для статьи и ваше предполагаемое использование не разрешено законодательными актами или превышает разрешенное использование, вам необходимо получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Эта статья цитируется в других статьях PMC.

Дополнительные материалы

Дополнительная информация

GUID: C0A2160D-4D51-4AED-BFB0-C7DBC4D9470F

Дополнительное видео 1

GUID: 3C61F0CF-1DE6-4F388-AE2000 ^{00 GUID 2 452 9102 9452 9452 ^{2 9452 9452 ^{02 -AD72-4E58-8878-42ADB11ADE2C}}}

Резюме

Вирус Т-клеточного лейкоза человека типа 1 (HTLV-1) сильно зависит от межклеточного взаимодействия для передачи и продуктивной инфекции. Сообщалось о межклеточных взаимодействиях через вирусологические синапсы, биопленочные структуры и клеточные каналы, но относительный вклад каждого механизма в передачу HTLV-1 все еще остается в значительной степени неизвестным. Было обнаружено, что белок p8 HTLV-1 увеличивает вирусную передачу и клеточные каналы. Здесь мы показываем, что клетки, экспрессирующие HTLV-1, связаны между собой туннельными нанотрубками (TNT), определяемыми как тонкие структуры, содержащие F-актин, и отсутствие тубулина, соединяющего две клетки. TNT соединяли экспрессирующие HTLV-1 клетки и неинфицированные Т-клетки и моноциты, а также вирусные белки Tax и Gag, локализованные в этих TNT.Было обнаружено, что белок p8, экспрессирующий HTLV-1, индуцирует образование TNT. Обработка клеток MT-2 нуклеозидным аналогом цитарабином (цитозинарабинозидом, AraC) уменьшала количество TNT и, кроме того, уменьшала образование TNT, индуцированное белком p8. Межклеточная передача HTLV-1 через TNT позволяет избежать распознавания иммунной системой. Цитарабин может представлять собой новый препарат против HTLV-1, препятствующий передаче вируса.

Введение

По оценкам, во всем мире не менее 5–10 миллионов человек инфицированы вирусом Т-клеточного лейкоза человека типа 1 (HTLV-1), первым обнаруженным онкогенным ретровирусом человека ^{¹ — ⁴}.В то время как большинство инфицированных людей остаются бессимптомными носителями на всю жизнь, через несколько десятилетий примерно у 3–5% развивается агрессивный Т-клеточный лейкоз / лимфома (ATL) взрослых, а у 1–4% — нейродегенеративное состояние, связанное с HTLV-1 миелопатией ( HAM) / тропический спастический парапарез (TSP) ^¹—⁶. Инфекции HTLV-1 также были связаны с воспалительными состояниями, такими как увеит, бронхоальвеолит и артрит, синдром Шегрена и полимиостис ^{⁷ — ¹⁰}.

In vivo , HTLV-1 был обнаружен в различных типах клеток, таких как CD4 ⁺ T-клетки, CD8 ⁺ T-клетки, дендритные клетки, макрофаги, B-клетки, эндотелиальные клетки и моноциты ^{¹¹ — ²¹}. Однако только CD4 ⁺ Т-клетки памяти подвергаются HTLV-1-зависимой клеточной трансформации и поэтому считаются основной клеточной мишенью этого вируса ^{²², ²³}. При вирусной инфекции переносчик глюкозы 1 (GLUT1), гепарансульфат-протеогликаны (HSPG) и нейропилин 1 (NRP-1) были идентифицированы как рецепторный комплекс HTLV-1, важный для связывания вируса и входа в клетки ^{²⁴, ²⁵}.Однако, в отличие от ВИЧ-1, бесклеточные частицы HTLV-1 в плазме людей, инфицированных HTLV-1, почти не обнаруживаются, и, за исключением дендритных клеток, внеклеточные инфекции очень неэффективны ^²⁶. Поэтому межклеточные контакты считаются основным и наиболее эффективным методом передачи и распространения HTLV-1 ^{²⁶ — ²⁹}. Таким образом, механизмы снижения передачи от клетки к клетке могут значительно снизить вирусную нагрузку.При передаче HTLV-1 описаны два разных межклеточных контакта. Вирусологический синапс (VS) определяется как индуцированное вирусом тесное межклеточное взаимодействие, создающее синаптическую межклеточную щель, обеспечивающую почкование и передачу вируса. Это вызывает вирусную поляризацию центра организации микротрубочек (MTOC) в донорской клетке по направлению к вирусологическому синапсу ^{³⁰, ³¹}. На поверхности инфицированных HTLV-1 клеточных линий ^³² были обнаружены вирусные биопленки, состоящие из внеклеточного матрикса и лектинов.Частицы HTLV-1 концентрируются и защищаются биопленками и передаются в клетку-мишень ^³². Для межклеточных взаимодействий на большие расстояния мы ранее сообщали о передаче вируса в Т-клетках через клеточные каналы, процесс, усиленный протеином p8, кодируемым HTLV-1, ^{³³, ³⁴}. Белок p8 образуется в результате двухэтапного протеолитического расщепления белка p12 ^³³, кодируемого открытой рамкой считывания 1 ( orf-I ) в геноме HTLV-1, который, как ранее было продемонстрировано, участвует в персистенции вируса. ^{³⁵ — ³⁷}.Сначала p12 расщепляется между аминокислотами в положениях 9 и 10, а затем между аминокислотами 29 и 30, причем природа аминокислот, окружающих эти сайты расщепления, определяет эффективность расщепления, и у людей, инфицированных HTLV-1, был обнаружен полиморфизм ^{³³, ³⁶}. Интересно, что сам белок p8 также переносится по клеточным каналам в соседние клетки ^{³⁴, ³⁸}. Передача HTLV-1 через эти типы межклеточных контактов может обеспечивать защиту от распознавания иммунной системой ^³⁴.

В настоящем исследовании мы дополнительно изучили межклеточные взаимодействия на больших расстояниях, используемые Т-клетками, экспрессирующими HTLV-1, и обнаружили, что эти инфицированные клетки образуют туннельные нанотрубки (TNT), часто содержащие вирусные белки Tax и Gag, между Т-клетками, а также моноцитами. TNT представляют собой тонкие (50-200 нм в диаметре) и длинные (5-100 мкм) межклеточные структуры, соединяющие клетки, лишенные контакта с субстратом, заключенные в плазматическую мембрану, содержащую нитчатый актин (F-актин) ^³⁹.Различные иммунные клетки взаимодействуют через TNT, включая естественные киллерные (NK) клетки, макрофаги, Т-клетки и B-клетки ^{⁴⁰ — ⁴²}. Сообщалось также о TNT в инфицированных ВИЧ-1 Т-клетках и макрофагах, в инфицированных гриппом клетках и клетках, инфицированных вирусом герпеса крупного рогатого скота 1 ^{⁴³ — ⁴⁸}. В недавнем исследовании мы продемонстрировали, что аналог пиримидинового нуклеозида цитарабин снижает активацию NF-κB и образование TNT в клетках острого миелоидного лейкоза (AML) ^⁴⁹.Здесь мы обнаружили, что лечение цитарабином также привело к снижению количества TNT в клетках HTLV-1. В клетках MT-2 цитарабин снижал экспрессию Tax, Gag и продукцию вирусов и вызывал снижение передачи вируса от клеток MT-2, а также от первичных инфицированных HTLV-1 клеток CD4 ⁺ в неинфицированные клетки. Посредством секвенирования orf-I в линиях клеток, инфицированных HTLV-1, включенных в это исследование, мы обнаружили, что клетки MT-2, демонстрирующие наибольшее количество TNT, содержали изоформу N26 orf-I , которая ранее продемонстрировала экспрессию в основном белок p8 ^³⁶.Экспрессия orf-I-N26 (p8) в клетках Jurkat усиливала образование TNT, тогда как обработка цитарабином снижала количество TNT, однако не влияя на экспрессию p8. Таким образом, наша работа показывает, что цитарабин может иметь возможные терапевтические эффекты для снижения передачи HTLV-1 за счет уменьшения связи инфицированных HTLV-1 клеток с неинфицированными клетками.

Результаты

Клетки, экспрессирующие HTLV-1, образуют туннельные нанотрубки (TNT)

Ранее мы сообщали о наличии клеточных каналов в экспрессирующих HTLV-1 клетках ^³⁴.В то время эти структуры не соответствовали строгим критериям TNT и поэтому были названы клеточными каналами ^³⁴. Поскольку было показано, что ВИЧ-1 способствует ТНТ для распространения вируса между Т-клетками и макрофагами ^{⁴³, ⁴⁴, ⁴⁸}, мы хотели определить, образуют ли инфицированные HTLV-1 клетки также ТНТ. Определение TNT в настоящем исследовании: тонкая (диаметром 200 нм, длина> 5 мкм) встроенная мембрана, содержащая актин, без тубулина, структура, соединяющая две клетки, одновременно парящие над поверхностью лунки.Цитоплазматические мостики, TNT-подобные структуры после деления клеток, были исключены через характерную среднюю часть тела ^{⁴⁸, ⁴⁹}. TNT являются очень хрупкими структурами in vitro и, следовательно, клеточной фиксацией; в частности, для суспензионных клеток, которые полуприлипают к покрытым фибронектином поверхностям, это приведет к разрушению TNT ^⁵⁰. Следовательно, суспензионные клетки обычно анализируются с помощью микроскопии живых клеток. Однако, поскольку клетки MT-2 продуцируют инфекционные вирусные частицы HTLV-1 ^{⁵¹, ⁵²}, они требуют фиксации перед анализом с помощью конфокальной микроскопии в обычных центрах микроскопии.В клетках МТ-2 обнаружены тонкие межклеточные связи> 5 мкм (рис.). Эти соединения не прилипали к пластиковой поверхности и содержали F-актин, но не содержали α-тубулина, и поэтому квалифицировались, согласно определению TNT, как TNT (рис.). Для дальнейшего более детального анализа TNT мы провели сканирующую электронную микроскопию (SEM). В клетках МТ-2 были обнаружены парящие над субстратом TNT, соединяющие клетки, и, что интересно, часто наблюдалось разветвленное закрепление только на одном конце (рис., стрелки), как также описано для других сотовых систем ^⁵³. Кроме того, в TNT наблюдались структуры в виде шишек (рис., Ii, наконечники стрелок), которые могли указывать на транспортировку груза через эти структуры, как описано ранее ^⁵⁴.

Клетки, экспрессирующие HTLV-1, образуют туннельные нанотрубки (TNT). ( A ) Клетки MT-2, окрашенные WGA-488 (клеточные мембраны, зеленый) и исследованные с помощью флуоресцентной микроскопии. Стрелки указывают на тонкие мембранные межклеточные связи.( B ) Клетки MT-2, окрашенные WGA-488 (зеленый), F-актин-фаллоидин-AF350 (синий) и антителом против α-тубулина (красный), и проанализированы с помощью конфокальной микроскопии. Стрелки указывают на тротил. Плоскость X-Z получается из Z-стека (всего 24 среза по 1 мкм каждый). ( C ) Сканирующая электронная микроскопия (SEM) клеток MT-2, связанных TNT. Увеличенное изображение вправо. Стрелки указывают на TNT, стрелки указывают на выпуклости TNT. Изображения были получены с помощью сканирующего электронного микроскопа Jeol JSM-7400F LEI 4.0 кВ, x3000 (x3700 для D2) и WD 8,0 мм. Изображения конфокальной микроскопии были получены с помощью конфокального микроскопа LSM780 (Zeiss), а флуоресцентная микроскопия была получена с помощью AxioObserver Z1 (Zeiss). Все изображения являются представителями трех независимых экспериментов, за исключением (C), который был проведен один раз. Все масштабные линейки 10 мкм, кроме увеличенных изображений SEM; 1 мкм. Для подготовки изображений использовался Adobe Photoshop CS6. Контраст был увеличен по всему изображению, чтобы лучше представить и визуализировать тонкие структуры TNT.

Зараженные HTLV-1 клеточные линии C91PL (продуцирование HTLV-1), C8166 (без вирусной продукции, но экспрессия белка Tax), две T-клеточные линии, полученные из ATL, TL-Om1 и ATL-ED (без вирусной продукции или Tax Expression) и HTLV-1-отрицательные клеточные линии Jurkat (T-клетки), CEM (T-клетки) и THP-1 (моноциты) были дополнительно сравнены с клетками MT-2 в отношении способности к образованию TNT. Все трансформированные HTLV-1 клеточные линии фиксировали и окрашивали WGA-Alexa488 перед анализом под микроскопом, тогда как HTLV-1-отрицательные клеточные линии анализировали с помощью визуализации живых клеток.Чтобы визуализировать TNT без необходимости окрашивания клеток, клетки Jurkat и THP-1 были стабильно трансдуцированы с помощью memGFP или memCherry, соответственно (см. Материалы и методы), чтобы непосредственно визуализировать TNT и различить исходную клетку (рис.). Чтобы сравнить образование TNT в различных клеточных линиях, TNT / 100 клеток определяли количественно, как описано ранее ^⁴⁹. Клетки MT-2 последовательно образовывали больше TNT по сравнению с другими HTLV-1-положительными клетками (рис.). Образование TNT в клетках MT-2 было аналогично количественному определению для нефиксированных клеток THP-1 и CEM, и, поскольку фиксация уменьшит количество TNT, как указано выше, и продемонстрированное сравнением фиксации клеток CEM дало 60.Снижение на 9% (p <0,0065) детектируемых TNT (рис.), Вероятно, что числа TNT в нефиксированных клетках MT-2 будут выше.

TNT в HTLV-1 положительных и отрицательных клетках. ( A ) Клетки Jurkat-memGFP (зеленые) и THP-1-memCherry (красные) анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Стрелки указывают тротилы. Изображения являются представителями трех независимых экспериментов. ( B ) TNT были количественно определены в клетках, трансформированных HTLV-1 (MT-2, C91PL, ATL-ED, TL-Om-1 и C8166), и в HTLV-1-отрицательных клеточных линиях; Т-клетки (CEM и Jurkat) и моноциты (THP-1).Количественное определение TNT в HTLV-1-отрицательных клетках выполняли с помощью микроскопии живых клеток, при этом непосредственно отображали клетки Jurkat-memCherry и THP-1-memGFP, в то время как клетки CEM окрашивали WGA-488 перед визуализацией. Все трансформированные HTLV-1 клетки фиксировали и окрашивали WGA-488 перед анализом под микроскопом. Для количественного определения TNT 100 клеток подсчитывали в дублирующих лунках на наличие TNT, соединяющих две клетки, как описано ранее ^⁴⁹. Результаты представляют собой три независимых эксперимента, выполненных в дубликатах, и среднее значение погрешностей ± стандартное отклонение.Непарный t-критерий был проведен для оценки статистической значимости. F-тест проводился для индивидуальных вариаций. Использовалась GraphPad Prism (версия 6.03) (** p <0,01). Шкала 10 мкм. Для подготовки изображений использовался Adobe Photoshop CS6. Контраст был увеличен по всему изображению, чтобы лучше представить и визуализировать тонкие структуры TNT.

Клетки, экспрессирующие HTLV-1, образуют TNT с неинфицированными Т-клетками и моноцитами, содержащими Tax и Gag

Для дальнейшего исследования связей TNT между HTLV-1-положительными и HTLV-1-отрицательными клетками, клетки MT-2 культивировали совместно. с ячейками Jurkat или THP-1.Эти культуры сравнивали с совместными культурами неинфицированных клеток Jurkat и THP-1. Во-первых, в культурах клеток THP-1 (memGFP) и Jurkat (memCherry) мы обнаружили, что TNT могут генерироваться из обеих клеток. Были обнаружены TNT, которые происходили из клеток Jurkat в направлении клеток THP-1 и наоборот (данные не показаны). Кроме того, были сформированы TNT, которые происходили из обоих типов клеток одновременно (фиг., Стрелки), как видно в других системах ^⁴⁸. Кроме того, в клетках Jurkat наблюдались точки memGFP, что, возможно, указывает на межклеточный транспорт из клеток THP-1 (рис., наконечники стрел). Когда неокрашенные клетки MT-2 совместно культивировали с клетками Jurkat (memCherry) или THP-1 (memGFP), TNT легко образовывались между HTLV-1-положительными и отрицательными клетками (фиг., Стрелки). Когда происхождение TNT, соединяющих клетки MT-2 и THP-1, было определено количественно, мы обнаружили, что 48% TNT происходили из клеток MT-2 и 52% из клеток THP-1 (дополнительный рисунок ^1A). неинфицированные клетки, точки memCherry и memGFP наблюдались в клетках MT-2. Произведена трехмерная реконструкция ячеек с рис.и показать memGFP, а также налог, присутствующий в ячейках получателя (дополнительное видео ¹). Это предполагает, что мембранный обмен происходит от HTLV-1-отрицательных клеток к клеткам MT-2 (рис., Стрелки), возможно, посредством TNT или других механизмов, таких как экзосомы и фагоцитоз. Когда совместно культивируемые клетки MT-2 и THP-1 были иммуноокрашены на внутриклеточный белок Tax, было обнаружено, что Tax локализован в TNT и может быть обнаружен в TNT, происходящих из клеток THP-1 (рис.), И в TNT, генерируемых обоими. Клетки МТ-2 и THP-1 (рис.). Специфичность иммуноокрашивания была подтверждена путем инкубации монокультуры клеток THP-1 (memGFP) с антителом против Tax, и, кроме того, отрицательная по Tax клетка THP-1 показана в совместной культуре с MT-2 и THP- 1 (memGFP) клетки (дополнительная фиг. ^{1B, C}). Это продемонстрировало, что HTLV-1-отрицательные клетки могут генерировать TNT для связи с MT-2 клетками с потенциальным транспортом компонентов мембраны и Tax-белка.

Клетки, экспрессирующие HTLV-1, образуют TNT с неинфицированными Т-клетками и моноцитами и содержат Tax.( A ) Клетки THP-1-memGFP и Jurkat-memCherry совместно культивировали в течение ночи, и наличие TNT анализировали с помощью DIC и флуоресцентной конфокальной микроскопии. Стрелки указывают TNT, а стрелки — memCherry и memGFP. ( B ) Клетки МТ-2 (неокрашенные) и Jurkat-memCherry культивировали совместно в течение ночи, и наличие TNT анализировали с помощью ДИК и флуоресцентной конфокальной микроскопии. Стрелки указывают тротилы, а стрелки — memCherry. ( C — E ) Клетки MT-2 и THP-1-memGFP совместно культивировали в течение ночи и иммуноокрашивали на Tax (красный).Наличие TNT анализировали с помощью ДИК и флуоресцентной конфокальной микроскопии. Стрелки указывают TNT, а стрелки memGFP (зеленые) или Tax (красные). Все изображения являются представителями двух независимых экспериментов, проведенных в двух экземплярах. Плоскость X-Z получается из Z-стека (всего 32 среза по 1 мкм каждый). Масштабная линейка 10 мкм. Для подготовки изображений использовался Adobe Photoshop CS6. Контраст был увеличен по всему изображению, чтобы лучше представить и визуализировать тонкие структуры TNT.

Затем клетки MT-2, культивированные совместно с THP-1 (memGFP), иммуноокрашивали на Gag.Мы обнаружили белки Gag, локализованные в TNT, генерируемые клетками MT-2 по отношению к клеткам THP-1, что может указывать на транспорт Gag от клеток MT-2 к клеткам THP-1 (рис.). Когда TNT, образованные между MT-2 и THP-1, были количественно определены на наличие Gag или Tax, мы обнаружили в среднем 40% TNT, содержащих Gag, и 18%, содержащих Tax (дополнительный рисунок ^1D). Между клетками MT-2 и THP-1 наблюдались как плотные, прямые межклеточные контакты, так и TNT, при этом некоторые клетки также одновременно участвовали в коммуникации TNT и прямых контактах (рис.). Мы также наблюдали, что когда клетка THP-1 и клетка MT-2 образовывали плотное соединение, как клетка THP-1, так и клетка MT-2 образовывали TNT-соединения с двумя клетками MT-2 на разных участках сайта прямого контакта ( Инжир. ). Наконец, белки Gag и memGFP также были локализованы в TNT, происходящих из клеток THP-1 и соединяющихся с клетками MT-2 (рис.). Было продемонстрировано, что этот memGFP или Gag является внутриклеточным путем трехмерной реконструкции Z-стека из фиг. (Дополнительное видео ²).

Gag присутствует в TNT, связывая клетки, экспрессирующие HTLV-1, и неинфицированные моноциты. ( A — C ) Клетки MT-2 и клетки THP1 — memGFP (зеленые) совместно культивировали в течение ночи, фиксировали и окрашивали на p24Gag (красный) перед исследованием соединений TNT с помощью DIC и флуоресцентной конфокальной микроскопии. Стрелками обозначены тротилы, а наконечники стрел — кляп. Плоскость X-Z получается из Z-стопки (всего 23 среза по 1 мкм каждый). Изображения являются представителями трех независимых экспериментов, выполненных в дубликатах.Масштабная линейка 10 мкм.

Лечение цитарабином снижает количество TNT в клетках, экспрессирующих HTLV-1

Цитарабин (AraC) представляет собой аналог дезоксицитидина (рис.), Который в сочетании с антрациклином представляет собой стандартную индукционную терапию для лечения пациентов с AML ^⁵⁵. Ранее мы продемонстрировали, что лечение соответствующими клиническими дозами цитарабина ^⁵⁶ снижает количество TNT в клетках AML, участвующих в пути NF-κB ^⁴⁹.Поскольку известно, что клетки HTLV-1, аналогичные клеткам AML, экспрессируют конститутивный активный путь NF-kB, опосредованный Tax ^{⁵⁷, ⁵⁸}, мы изучили влияние цитарабина на TNT в клетках, инфицированных HTLV-1, и HTLV-1 отрицательная Т-клеточная линия CEM. Клетки MT-2, C91PL, TL-Om1, ATL-ED и CEM обрабатывали 1 мкМ цитарабина в течение 24 часов с последующей фиксацией линий клеток, экспрессирующих HTLV-1, и количественным определением TNT по сравнению с необработанными клетками (рис.) . Это вызвало гибель 11% клеток в клетках МТ-2 и <5% в других клеточных линиях, как определено окрашиванием Hoechst 33342 после микроскопии (данные не показаны), и числа TNT были определены количественно только между живыми клетками, и они были значительно снижены в Клетки МТ-2 после обработки цитарабином, тогда как в клетках СЕМ не было обнаружено значительных изменений (рис.). Другие HTLV-1-положительные клеточные линии, которые экспрессировали низкие числа TNT, продемонстрировали незначительное снижение после лечения цитарабином. Чтобы определить, влияет ли обработка цитарабином на высвобождение вируса, измеряли p19Gag (пг / мл) в супернатанте ложно обработанных или обработанных 1 мкМ цитарабином клеток МТ-2. Лечение цитарабином привело примерно к 30% снижению p19Gag (рис.). Когда внутриклеточный p24Gag в клетках MT-2 оценивался с помощью иммуноблоттинга через 24 часа обработки цитарабином (1 мкМ), мы обнаружили уменьшение предшественника p55Gag и увеличение p24Gag (рис.). В то время как это было не так очевидно в обработанных цитарабином клетках C91PL (фиг.). Кроме того, обработка цитарабином также приводила к снижению экспрессии белка Tax в клетках МТ-2 (фиг.), Что указывает на связь между числами Tax и TNT.

Обработка цитарабином снижает количество TNT в клетках, экспрессирующих HTLV-1. ( A ) Молекулярная структура цитарабина (AraC). ( B ) Количественное определение TNT в клеточных линиях до и после обработки цитарабином (AraC) (1 мкМ, 24 ч). ( C ) Количественное определение p19 Gag (пг / мл) с помощью набора ELISA для захвата антигена HTLV-1 в супернатанте MT-2 до и после обработки AraC (1 мкМ, 24 ч).( D ) Иммуноблоттинг клеток ATL-ED, MT-2 и C91PL до и после обработки AraC (1 мкМ, 24 ч) антителами против p24 / p55 Gag и COXIV (контроль нагрузки). ( E ) Иммуноблоттинг клеток C8166, CEM, TL-Om1, ATL-ED, MT-2 и C91PL до и после обработки AraC (1 мкМ, 24 ч) антителами против Tax и COXIV (контроль нагрузки). ( F ) Иммуноблоттинг клеток Jurkat и JPX9 (Tax wt) до и после обработки CdCl ₂; антитела против Tax, M-Sec и COXIV (контроль нагрузки).Лизаты клеток C91PL: положительный контроль экспрессии Tax и M-Sec. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. ( G ) Количественная оценка TNT в клетках JPX9 до и после обработки CdCl ₂. Все планки погрешностей указывают среднее значение ± стандартное отклонение. Для количественной оценки TNT; все данные представлены в виде трех независимых экспериментов в дубликатах, количественная оценка p19 Gag; все данные представлены в процентах в виде трех независимых экспериментов. Иммуноблоты являются представителями трех независимых экспериментов.Для оценки статистической значимости был проведен непарный t-критерий. F-тест проводился для индивидуальных вариаций. Использовалась GraphPad Prism (версия 6.03) (* p <0,05, ** p <0,01). Масштабные линейки: 10 мкм. Полноразмерные иммуноблоты представлены на дополнительном рисунке ².

Для дальнейшего исследования роли Tax в образовании TNT мы использовали клеточную линию JPX9, производную Jurkat, которую можно индуцировать с помощью CdCl ₂ для экспрессии Tax ^⁵⁹.Хотя мы смогли обнаружить индукцию белка Tax в клетках JPX9 с помощью иммуноблоттинга (рис.), Мы не обнаружили разницы в числах TNT (рис.). Индукция Tax дикого типа также увеличивала экспрессию белка M-Sec (TNF-альфа-индуцирующий белок 2) (фиг.), Который, как ранее сообщалось, является центральным белком для образования TNT ^⁶⁰. На основании этого мы пришли к выводу, что Tax и M-Sec, скорее всего, не важны для образования TNT в клетках, инфицированных HTLV-1.

Цитарабин снижает передачу вируса

Чтобы определить, влияет ли цитарабин на передачу от клетки к клетке и инфекцию, мы использовали репортерную систему клеток BHK1E6.Клетки BHK1E6 содержат ген lacZ , управляемый промотором HTLV-LTR, что позволяет использовать β-галактозидазу в качестве меры активации LTR с помощью Tax ^⁶¹. Сначала клетки BHK1E6 исследовали на наличие TNT до и после обработки цитарабином (1 мкМ) в течение 24 часов. Клетки BHK1E6 экспрессировали в среднем 2 TNT / 100 клеток, которые не изменились после обработки цитарабином, и в клетках BHK1E6 после обработки не было обнаружено гибели клеток по сравнению с клетками MT-2 (фиг.). После совместного культивирования наблюдались TNT-подобные структуры, связывающие клетки MT-2 и BHK1E6 (данные не показаны), и процент продукции β-галактозидазы был значительно снижен примерно на 25% в присутствии цитарабина (1 мкМ, 24 часа) и Было обнаружено последовательное, но не значительное уменьшение клеточного супернатанта p19Gag (рис.). Чтобы исследовать перенос вируса с использованием новых инфицированных HTLV-1 клеток, мы инфицировали первично отсортированные клетки CD4 ⁺ из здоровых мононуклеарных клеток периферической крови путем совместного культивирования со смертельно облученными γ-клетками 729.6 клеток, экспрессирующих молекулярный клон pAB HTLV-1, как описано ранее ^³⁷. Этот молекулярный клон содержит orf-I , кодирующий аспарагиновую кислоту в положении 26, что приводит к одинаковой экспрессии белков p12 и p8 ^³⁶, и поэтому эти вновь инфицированные клетки CD4 ⁺ называются CD4 ⁺ -pAB -D26. Чистоту клеток CD4 ⁺ -pAB-D26 измеряли с помощью проточной цитометрии, в то время как проверку присутствия HTLV-1 Gag проводили с помощью ПЦР на изолированной ДНК, и было обнаружено, что провирусная нагрузка составляет 265.6% на 58 день в культуре (рис. И дополнительный рис. ³). Расчет провирусной нагрузки (%) был основан на количестве копий HTLV-1 на 100 копий гена РНКазы P. Когда клетки CD4 ⁺ -pAB-D26 совместно культивировали с клетками BHK1E6, между этими клетками наблюдались TNT-подобные структуры (фиг.). После лечения в течение 24 часов цитарабином (1 мкМ, 5% гибели клеток, измеренной по окрашиванию Hoechst 33342) или ингибитором обратной транскриптазы AZT (азидотимидин, зидовудин, 10 мкМ, 4% гибели клеток, измеряемым окрашиванием Hoechst 33342), включенный в качестве одного из варианты лечения пациентов с ATL сегодня ^⁶², мы обнаружили, что количество TNT-подобных структур, соединяющих клетки CD4 ⁺ -pAB-D26 и клетки BHK1E6, уменьшилось на 44% после лечения цитарабином, но не AZT (Инжир.) и, что интересно, обработка цитарабином привела к 30% снижению количества положительных по β-галактозидазе клеток (рис.). Не было обнаружено значительного изменения p19Gag в супернатанте совместной культуры (рис.), Что не объясняет уменьшение количества синих клеток (положительных по β-галлонам) в анализе на передачу. Ранее мы показали, что цитарабин может ингибировать образование TNT ^⁴⁹, но здесь мы не исключаем другие механизмы передачи передачи Tax в клетки BHK1E6. Поскольку Tax были обнаружены в экзосомах ^⁶³, разница в восстановлении между TNT-подобными структурами и положительными по β-галактозидазе клетками может быть объяснена обменом везикул или другими способами передачи Tax.В заключение мы обнаружили, что 24-часовая терапия цитарабином снижает передачу вируса, чего не обнаруживается после лечения AZT.

Цитарабин, но не AZT, значительно подавляет передачу вируса и TNT-подобные структуры между первичными клетками CD4 ⁺ -pAB-D26 и BHK1E6 ( A ) Количественное определение TNT клеток BHK1E6 (BHK) и клеток MT-2 до и после обработка цитарабином (AraC) (1 мкМ, 24 часа). Количественное определение TNT между монокультурами клеток BHK1E6 и MT-2. ( B ) Совместное культивирование клеток MT-2 и BHK1E6 (BHK) (24 ч) с 1 мкМ AraC или ctr, окрашенными на активность β-галактозидазы (синие клетки), процент от трех независимых экспериментов, выполненных в дубликатах.( C ) Количественная оценка p19 Gag (пг / мл) в супернатантах экспериментов по совместному культивированию в ( B ) с помощью набора ELISA для захвата антигена HTLV-1 ( D ) Подтверждение наличия Gag в первичных CD4 ^{+ Клетки}-pAB-D26 с помощью ПЦР, неинфицированные клетки CD4 ⁺ и клетки 729,6 показаны как отрицательные контроли, клетки 729,6-pAB-D26 и MT-2 показаны как положительные контроли. ( E ) TNT-подобная структура между CD4 ⁺ -pAB-D26, окрашенным синим трекером клеток, в совместной культуре с клетками BHK1E6, стрелка указывает на TNT-подобную структуру.На увеличенном изображении черная звезда обозначает клетку BHK1E6, а белая звезда CD4 ⁺ -pAB-D26. Изображение представляет три независимых эксперимента, выполненных в двух экземплярах. ( F ) Количественная оценка TNT-подобных структур между клетками CD4 ⁺ -pAB-D26 и BHK1E6, совместно культивированными в течение 24 часов с 10 мкМ AZT, 1 мкМ AraC или только в среде. В каждом эксперименте подсчитывали 100 клеток CD4 ⁺ D26. Показан средний процент из трех независимых экспериментов, выполненных в дубликатах. ( G ) Совместное культивирование клеток CD4 ⁺ -pAB-D26 и клеток BHK1E6 (24 ч) с ctr, 10 мкМ AZT или 1 мкМ AraC, окрашенных на активность β-галактозидазы (синие клетки), процент от трех независимых эксперименты проводились в двух экземплярах.( H ) Количественное определение p19 Gag (пг / мл) в супернатантах экспериментов по совместному культивированию в ( G ) с помощью набора ELISA для захвата антигена HTLV-1. Все количественные определения p19 Gag представлены в процентах от трех независимых экспериментов. Все планки погрешностей указывают среднее значение ± стандартное отклонение. Непарный t-критерий был проведен для оценки статистической значимости. F-тест проводился для индивидуальных вариаций. Использовалась GraphPad Prism (версия 6.03) (** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0.001, н.у. незначительный). Полноразмерные изображения геля представлены на дополнительном рисунке ⁴.

p8 индуцирует образование TNT в неинфицированных Т-клетках

Поскольку мы ранее сообщали, что p8 индуцирует клеточные каналы, и мы наблюдали разницу в способности образовывать TNT среди HTLV-1-положительных клеточных линий, мы исследовали последовательность orf-I в эти клетки (рис.). Интересно, что линия клеток MT-2, которая имела самые высокие числа TNT, содержала провирус, кодирующий аспарагин в положении 26 (N26) orf-I , изоформу, которая, как мы ранее продемонстрировали, в основном экспрессирует белок p8, индуктор передачи вируса. ^{³⁴, ³⁶}.За исключением клеток C91PL, остальные клеточные линии HTLV-1, включая первично инфицированные клетки CD4 ⁺ pAB-D26, кодировали изоформу с аспарагиновой кислотой в положении 26 (D26), что приводило к примерно эквивалентной экспрессии p12 и p8 ^³⁶. Клеточная линия C91PL содержала провирус, кодирующий глицин в положении 26 (G26), также было обнаружено, что он экспрессирует равные количества белков p12 и p8 (неопубликованные данные).

Белок p8 увеличивает образование TNT. ( A ) Аминокислотные последовательности Orf-I позитивных по HTLV-1 клеточных линий.( B ) Эффективность трансдукции определяли с помощью проточной цитометрии процентного содержания GFP-положительных клеток в клетках Jurkat-memCherry, трансдуцированных pSDM, pSDM-N26 (p8) -HA или pSDM-G29S (p12) -HA. ( C ) Иммуноблоттинг клеток Jurkat-memCherry (ctr), Jurkat-memCherry; pSDM, pSDM-G29S-HA и pSDM-N26-HA, инкубированные с антителом против HA. β-актин использовали в качестве контроля нагрузки. ( D ) Количественное определение тротила Jurkat-memCherry; pSDM, pSDM-G29S-HA и pSDM-N26-HA. Результаты представлены как среднее значение трех независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах.( E ) Проверка TNT в клетках Jurkat-memCherry-pSDM-N26-HA. Клетки фиксировали и окрашивали фаллоидином AF350 для визуализации F-актина (синий) и анти-α-тубулина для визуализации тубулина (голубой, AF633), трансдуцированные клетки являются GFP-положительными, плазматическая мембрана memCherry (красный). Шкала шкалы: 10 мкм. Результат представляет три независимых эксперимента. ( F ) Клетки Jurkat-memCherry-pSDM-N26-HA не обрабатывали или обрабатывали 1 мкМ цитарабином (AraC) в течение 24 часов, а TNT количественно определяли в живых клетках.Результаты представлены как среднее значение трех независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах. ( G ) Иммуноблоттинг клеток Jurkat-memCherry-pSDM-N26-HA, не обработанных или не обработанных 1 мкМ AraC, инкубированных с антителом против НА. β-тубулин использовали в качестве контроля нагрузки. Показан репрезентативный блот трех независимых экспериментов. Для оценки статистической значимости был проведен непарный t-критерий. F-тест проводился для индивидуальных вариаций. Использовалась GraphPad Prism (версия 6.03) (** p <0.01, *** р ≤ 0,001). Полноразмерные иммуноблоты представлены на дополнительном рисунке ⁵. Для подготовки изображений использовался Adobe Photoshop CS6. Контраст был увеличен по всему изображению, чтобы лучше представить и визуализировать тонкие структуры TNT.

Для дальнейшего изучения роли p8 в образовании TNT мы стабильно трансдуцировали клетки Jurkat memCherry либо лентивирусным пустым векторным контролем, экспрессирующим GFP (pSDM), либо pSDM, экспрессирующим orf-I, неспособное протеолитически расщепляться и, следовательно, продуцирующее только p12; G29S ^³³ (p12) -HA или N26 (p8) -HA, продуцирующий в основном белок p8 ^³⁶.Эффективность трансдукции определяли с помощью проточной цитометрии как процент GFP-положительных клеток; pSDM: 96%, pSDM-N26 (p8) -HA: 69% и pSDM-G29S (p12) -HA: 87% (фиг.), и экспрессию подтверждали иммуноблоттингом (фиг.). После этого была проведена количественная оценка TNT живых клеток, включая только GFP-положительные клетки. Мы обнаружили, что по сравнению только с клетками Jurkat-memCherry, трансдукция с помощью pSDM приводила к снижению количества TNT, однако не было обнаружено значительных различий между клетками pSDM и клетками pSDM-G29S (p12) -HA (рис.). PSDM-N26 (p8) -HA-положительные клетки показали значительную индукцию TNT ( p = 0,0088) по сравнению с pSDM или pSDM-G29S (p12) -HA-положительными клетками (фиг.). Было подтверждено, что структуры содержат F-актин и не содержат тубулина. Однако тубулин можно было обнаружить на обоих концах структуры TNT (рис.), Что также наблюдалось другими ^⁶⁴. В соответствии с тем, что мы наблюдали в клетках, продуцирующих HTLV-1, обработка клеток, экспрессирующих pSDM-N26 (p8) -HA, 1 мкМ цитарабина (8% гибель клеток, измеренная с помощью окрашивания Hoechst 33342) приводила к значительному (p <0.0001) подавление образования TNT (фиг.) Без влияния на экспрессию p8 (фиг.).

В совокупности мы показали, что клетки, экспрессирующие HTLV-1, связаны между собой строго определенными межклеточными структурами TNT, а также с неинфицированными Т-клетками и моноцитами. Было обнаружено, что TNT происходят либо от HTLV-1-положительных клеток, либо от HTLV-1-отрицательных клеток. Используя memGFP и memCherry, стабильно экспрессирующие клетки, мы обнаружили присутствие белков memGFP, memCherry, Tax и Gag в TNT, что указывает на потенциальный транспорт этих белков через TNT.Лечение цитарабином привело к снижению TNT, продукции вируса и передачи вируса. Экспрессия orf-I-N26 в клетках Jurkat увеличивает количество образования TNT, которое значительно снижается при обработке цитарабином.

Обсуждение

TNT представляют собой прямую связь между ячейками на большом расстоянии, где ячейки могут обмениваться материалом. Было высказано предположение, что TNT играют роль в различных заболеваниях, таких как рак и инфекционные заболевания, включая химиорезистентность и распространение патогенов ^{⁴⁷ — ⁴⁹, ⁶⁵ — ⁷⁰}.

Ретровирусы используют клетки-хозяева для своей репликации и вирусного распространения. В частности, HTLV-1 сильно зависит от межклеточного взаимодействия между иммунными клетками для успешного переноса и установления продуктивной инфекции ^²⁸. Здесь мы обнаруживаем, что инфицированные HTLV-1 клетки соответствовали строгому определению TNT. Эти клетки выражали тонкие межклеточные связи длиной не менее 5 мкм, которые не контактировали с субстратом. Клетки MT-2 содержали F-актин и не содержали тубулина, и с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) было подтверждено, что эти структуры являются тонкими (<200 нм) и, что интересно, часто имеют разветвленную точку привязки, что было ранее описано для TNT ^⁵³.Эти TNT часто наблюдались с несколькими ручками, указывающими на транспортировку.

Изменения в количестве TNT наблюдались среди линий клеток, инфицированных HTLV-1. Линии Т-клеток ATL (TL-Om1, ATL-ED), которые имеют интегрированный провирус, но не экспрессируют Tax или высвобождающий вирус, образовывали меньше TNT, чем клеточная линия MT-2, продуцирующая HTLV-1, и демонстрировали большее сходство с HTLV. -1, экспрессирующая клеточную линию C91PL и клеточную линию C8166, содержащую дефектный провирус, но экспрессирующую белок Tax. Однако количественное определение TNT было затруднительным в клетках C91PL и C8166 из-за роста их клеточных культур в больших кластерах, которые особенно трудно разделить на отдельные клетки.В культурах клеток многие линии Т-клеток растут в кластерах, что, скорее всего, отражает экспрессию молекул адгезии на клеточной поверхности, и эта экспрессия и распределение могут влиять на образование TNT. В клетках, которые растут в такой непосредственной близости, вирусы, скорее всего, будут использовать тесную межклеточную коммуникацию, а не связь TNT на большом расстоянии.

Ранее сообщалось, что как мембранные нанотрубки, так и клеточные каналы соединяют инфицированные и неинфицированные Т-клетки ^{³⁴, ⁴⁸}.Совински и его сотрудники продемонстрировали перенос вирусных белков Gag и Env вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) между двумя популяциями Т-клеток ^⁴⁸. Ранее мы показали, что клеточные каналы могут использоваться для транспортировки Gag и белка p8, кодируемого HTLV-1, из клеток MT-2 в неинфицированные клетки Jurkat ^³⁴. Помимо определения клеточных структур, мы хотели исследовать с помощью систем совместного культивирования клеточное происхождение образующихся TNT.Для этого мы создали клетки Jurkat и THP-1, стабильно экспрессирующие memCherry или memGFP соответственно. Ранее сообщалось о мембранных нанотрубках для клеток Jurkat и THP-1 ^⁴⁸. Мы были особенно заинтересованы в изучении образования TNT между Т-клетками и моноцитами, поскольку недавно мы продемонстрировали вирусную ДНК в трех различных субпопуляциях моноцитов от людей, инфицированных HTLV-1 ^¹². Кроме того, инфицирование моноцитов HTLV-1 связано с изменениями экспрессии и функции поверхностных маркеров ^¹².Во-первых, мы установили, что клетки THP-1 и Jurkat могут образовывать TNT с инфицированными Т-клетками, и они происходят из обоих типов клеток. Это предполагает, подобно тому, что было сообщено Sowinski и соавторами для Т-клеток, что TNT, образующиеся между Т-клетками и моноцитами, не являются открытыми ^⁴⁸. Следствием этой особенности является то, что потенциальная транспортировка груза не является пассивной только через срезанную мембрану, а в основном включает в себя активный транспорт с моторным приводом. Дальнейшая проверка компонентов образующихся TNT необходима для заключения, как происходит этот транспорт, путем окрашивания моторными белками, такими как Myosin Va ^{³⁹, ⁴⁸, ⁷¹}.Мы обнаружили, что образование TNT между инфицированными и неинфицированными клетками происходит от обоих; от клеток MT-2 до клеток Jurkat и THP-1 или от клеток Jurkat и THP-1 до клеток MT-2. Интересно, что после количественной оценки белок Tax был локализован в 18% TNT, соединяющих клетки MT-2 и THP-1. Также было обнаружено, что белок Tax локализован в TNT, происходящих от THP-1 по направлению к клеткам MT-2. Это может указывать на транспорт белка Tax от клеток MT-2 к неинфицированным клеткам с использованием TNT, генерируемых неинфицированными клетками.Поскольку эти клетки, продуцирующие HTLV-1, требовали фиксации, мы, к сожалению, не смогли выполнить покадровую визуализацию живых клеток для дальнейшего изучения транспорта налогов через TNT. Поскольку не было продемонстрировано, что белок Tax является частью вирусной частицы, перенос белка Tax, вероятно, не зависит от вирусной инфекции клетки-реципиента. Перенос налога может вызвать различные изменения в неинфицированной клетке, поскольку было показано, что налог влияет на большое количество клеточных путей ^⁵⁸.Необходимы дальнейшие исследования с целью изучения функционального эффекта переноса налогов. Кроме того, мы наблюдали GFP-положительные точки в клетках MT-2, что означает обмен грузами в обоих направлениях. Эти наблюдения подтверждают возможность того, что инфицированные HTLV-1 клетки могут использовать TNT, генерируемые неинфицированными клетками, по направлению к инфицированным для транспортировки вирусных белков, сигнальных молекул и самого вируса. В соответствии с этим мы обнаружили Gag в 40% TNT, соединяющих клетки MT-2 и клетки THP-1.Как видно из Tax, белок Gag также наблюдался в TNT, происходящих из клеток THP-1. Белок Gag в TNT может представлять Gag, включенный как часть вирусной частицы, и / или он также может представлять только белок Gag. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше охарактеризовать вирусные частицы, активно транспортируемые через TNT.

Мы часто наблюдали, что TNT образуются из одной или обеих клеток, уже находящихся в прямом контакте с другими клетками. Это может указывать на то, что ранее описанные вирусологические синапсы и биопленочные структуры могут быть процессами, происходящими одновременно с образованием TNT, и один процесс может также активировать начало другого.Это означает, что когда TNT используются для переноса вируса и вирусных белков, это может быть частью нескольких подходов, которые каждая клетка может использовать для распространения вируса.

Ранее мы показали, что образование TNT подавлялось обработкой цитарабином через NF-кB-зависимый механизм в клетках AML ^⁴⁹. Поскольку инфицированные HTLV-1 клетки имеют некоторые общие черты с клетками AML, такие как конститутивная активация пути NF-кB, клетки MT-2 обрабатывали клинически значимой ^⁵⁶ и преапоптотической дозой цитарабина (1 мкМ). ) в течение 24 часов (≤11% смерти).Это лечение привело к снижению количества TNT и снижению уровня белка Tax. Интересно, что в клетках MT-2 мы обнаружили, что белок p24 Gag был немного увеличен после обработки цитарабином с соответствующим уменьшением предшественника p55 Gag. Мы также отметили снижение количества супернатанта p19 Gag на 33%. Это предполагает, что цитарабин может изменять процессинг Gag и процесс почкования вируса. Поскольку известно, что Tax вызывает конститутивную активацию NF-κB, а цитарабин снижает уровни белка Tax, мы исследовали потенциальную роль Tax в образовании TNT с использованием индуцируемой Tax клеточной линии Jurkat ^{⁵⁸, ⁷²}.Индукция Tax показала увеличение индуцируемого фактора некроза опухоли α белка 2 (TNFαIP2), также называемого M-Sec. Предполагается, что M-Sec будет ключевым игроком в формировании TNT ^{⁴⁴, ⁶⁰}. Однако не было обнаружено значительных различий в количестве TNT между клетками, индуцированными Tax, и неиндуцированными клетками, что согласуется с нашими предыдущими результатами ^³⁴. Это указывает на то, что в этих Т-клетках образование TNT не регулируется в значительной степени экспрессией M-Sec и / или Tax и что образование TNT, скорее всего, регулируется иначе в клетках AML по сравнению с клетками, инфицированными HTLV-1.

В этом исследовании мы демонстрируем, что вирусный белок p8 индуцировал образование TNT и что вариация, обнаруженная среди HTLV-1-положительных клеточных линий, соответствовала экспрессированной изоформе orf-I . Линии клеток, которые имели низкое образование TNT (TL-Om1, ATL-ED, C91PL и C8166), все кодировали изоформу orf-I , ранее показанная для экспрессии белков как p12, так и p8; тогда как клетки MT-2, кодирующие изоформу orf-I , в основном экспрессируют изоформу p8. Аналогичным образом, в Т-клетках, трансдуцированных лентивирусом, который экспрессировал orf-I -N26, таким образом, p8, мы наблюдали увеличение образования TNT, которое подавлялось обработкой цитарабином.

Чтобы выяснить, влияет ли цитарабин на перенос HTLV-1, мы провели анализ передачи вируса путем совместного культивирования BHK1E6, содержащего репортерный ген lacZ, управляемый промотором HTLV-1 LTR, с клетками MT-2. Клетки MT-2 генерировали TNT-подобные структуры с клетками BHK1E6, и обработка цитарабином снижала количество положительных по β-галактозидазе клеток BHK1E6 на 25%, что указывает на то, что цитарабин может ингибировать перенос вируса.

Противовирусные эффекты цитарабина и подавление Tax делают цитарабин интересным препаратом для дальнейших исследований.Было показано, что белок Tax обладает плейотропными эффектами и предполагается, что он участвует в трансформации Т-клеток в ATL ^{⁵⁸, ⁷³}. Несмотря на небольшую вирусную экспрессию или ее отсутствие, около 40% пациентов с ATL продолжают экспрессировать Tax в своих инфицированных HTLV-1 Т-клетках ^⁷⁴. Лекарства, которые влияют на экспрессию Tax и активацию NF-κB, использовались в качестве терапевтических средств в ATL ^⁵⁸. Другие показали, что комбинация триоксида мышьяка и интерферона альфа является эффективным лечением ATL из-за деградации Tax ^{⁷⁵, ⁷⁶}.Таким образом, цитарабин потенциально может представлять собой альтернативу применению при лечении ATL, что дополнительно подтверждается тем фактом, что подавление вирусной экспрессии было вызвано использованием клинически значимой дозы цитарабина ^⁵⁶. Поскольку более высокие вирусные нагрузки связаны с прогрессированием заболевания ^{⁷⁷, ⁷⁸}, цитарабин из-за его эффектов на образование TNT и передачу HTLV-1 может представлять собой многообещающее терапевтическое средство. Было бы интересно дополнительно изучить эффективность цитарабина на in vivo животных моделях HTLV-1.

Материалы и методы

Клетки и условия культивирования

Положительные по HTLV-1 клеточные линии MT-2, C91PL, C8166, TL-Om1 и ATL-ED и отрицательные по HTLV-1 клеточные линии Jurkat, THP-1 и Tax-индуцируемые клетки. Клетки JPX9 (любезный подарок лаборатории доктора Гиама из USHS) все выращивали в среде RPMI-1640. Клетки BHK1E6 (HTLV-1-LTR-lacZ) ^⁶¹ выращивали в среде Дульбекко, модифицированной орлами (DMEM). Все среды для культивирования клеток были дополнены 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 2 мг / мл L-глутамина, 100 ед. Пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (Quality Biological).Т-клетки периферической крови человека (или лейкоциты / пакеты для лейкафереза) были получены от здоровых доноров по протоколу 99-CC-0168 NIH, одобренному NCI IRB. Доноры крови для исследований предоставили письменное информированное согласие, и образцы крови были обезличены перед распределением в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Первичные клетки CD4 ⁺ -pAB-D26 культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и 100 ед. Интерлейкина-2 в дополнение к L-глутамину и антибиотикам. Клетки THP1-memGFP и Jurkat-memCherry были получены путем трансдукции клеток THP-1 и Jurkat готовыми к использованию лентивирусными частицами, экспрессирующими двадцать аминокислот N-концевой части нейромодулина, содержащего сигнал пальмитоилирования, слитый с GFP или Cherry (Takara , rLV-EF1-AcGFP-Mem-9; rV2.1A1.1941 C2, rLV.EF1.mCherry-Mem-9; rV2.1A1.2406 C2), соответственно, согласно инструкциям производителя. Клетки THP1-memGFP и Jurkat-memCherry были отсортированы с помощью BD FACS Aria SORP в Core Facility Flow Cytometry, Департамент клинических наук, Университет Бергена, Норвегия.

Определение и количественное определение TNT

70000 клеток высевали на микролунки, покрытые фибронектином (10 мкг / мл) (IBIDI), и инкубировали в течение 24 часов без или с 1 мкМ цитарабина (AraC) (Hospira, 100 мг / мл) .Клетки окрашивали 1,67 мкг / мл агглютинина зародышей пшеницы (WGA), конъюгированного с Alexa Fluor 488 или 594 (Life Technologies), в течение 8 минут при 37 ° C и один раз промывали DPBS1x (Gibco) перед фиксацией 4% PFA (Electron Microscopy Sciences ) и 0,2% глутарового альдегида (электронная микроскопия) в течение 15 мин при комнатной температуре (КТ) и дважды осторожно промыли перед исследованием под микроскопом. TNT в настоящем исследовании определяется и идентифицируется как тонкая структура (<200 нм), соединяющая две клетки без контакта с субстратом.Кроме того, эти TNT проверяются по содержанию F-актина и отсутствию микротрубочек. Подсчитывали 100 клеток, как описано ранее. ^⁴⁹ в каждой лунке в дубликатах, и каждый эксперимент выполняли как независимые трижды, если не указано иное. Жизнеспособность клеток контролировали окрашиванием Hoechst 33342 (Sigma), как описано ранее ^⁷⁹.

TNT проверка

Клетки окрашивали WGA-488 (1,67 мкг / мл) в течение 10 мин при комнатной температуре, промывали один раз PBS, проницаемость 0.2% TWEEN 20 (монолаурат полиоксиэтиленсорбитана) (Bio-Rad) в PBS в течение 1-2 мин, промывали PBS и инкубировали в 0,5% BSA в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого клетки окрашивали на F-актин путем инкубации с фаллоидином Alexa Fluor 350 (0,33 мкМ) в течение 1 ч при комнатной температуре, один раз промывали PBS и окрашивали на тубулин путем инкубации с антителом к α-тубулину (1: 100, Sigma ) в течение ночи при 4 ° C. Клетки дважды промывали PBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте с козьими антимышиными Alexa Fluor 568 (1: 5000, Invitrogen) или Alexa Fluor 633 (1: 5000, Invitrogen).Наконец, клетки дважды промывали PBS перед анализом с помощью флуоресцентной микроскопии.

Иммунофлуоресценция

Клетки фиксировали 4% PFA (электронная микроскопия) и 0,2% глутаровым альдегидом в течение 15 минут, промывали один раз PBS перед проницаемостью 0,2% TWEEN 20 в PBS в течение 1 минуты. Затем клетки промывали один раз перед блокировкой 0,5% BSA в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем клетки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с антителом против p24 Gag (ABL # 4310 ABL inc., 1:50) или в течение ночи при 4 ° C с моноклональным антителом против Tax (Tab172 ^⁸⁰, 1: 10), затем дважды промывали PBS с последующей инкубацией с козьим антимышиным Alexa Fluor 568, как описано ранее.Наконец, клетки дважды промывали PBS перед исследованием с помощью флуоресцентной микроскопии.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM)

Покровные стекла, добавленные в лунки 24-луночного планшета, были предварительно покрыты фибронектином (10 мкг / мл) перед посевом 450 000 клеток МТ-2 на лунку. Клетки инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C, а затем фиксировали в течение ночи при 4 ° C, используя 2% глутаральдегид в 0,1 М Na-какодилатном буфере. Затем клетки промывали 3 раза по 15 минут 0,1 М Na-какодилатным буфером, затем фиксировали в 1% осмийтетраоксиде (OsO ₄) в Na-какодилатном буфере в течение 1 часа при 4 ° C и промывали 2 раза по 10 минут в растворе 0. .1 М Na-какодилатный буфер перед дегидратацией. Дегидратацию проводили следующим образом: 30% этанол в течение 15 минут, 50% этанол в течение 15 минут, 70% этанол в течение ночи, 96% этанол в течение 20 минут и 2 × 100% этанол в течение 20 минут. После фиксации и обезвоживания покровные стекла помещали на отрезки SEM перед инкубированием в термостате в течение ночи. Сушка в критической точке была выполнена перед тем, как заглушки SEM были покрыты 5–10 нм золотом / палладием перед исследованием клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Клетки JPX9

Клетки JPX9 представляют собой стабильные трансфицированные клетки Jurkat, содержащие Tax дикого типа, индуцируемые промотором металлотионеина ^⁵⁹.Этот промотор активируется обработкой CdCl ₂. Клетки JPX9 (1,5–2,5 × 10 ⁶) высевали в 6-луночные планшеты без или с 20 мкМ CdCl ₂ (Sigma) в течение 48 часов, и экспрессию Tax проверяли с помощью иммуноблот-анализа. Для микроскопического анализа 35 000 клеток высевали в µ-лунки, предварительно покрытые фибронектином, не обрабатывали или обрабатывали 20 мкМ CdCl ₂ в течение 48 часов перед окрашиванием WGA-488 и исследовали с помощью микроскопии живых клеток.

Анализы совместного культивирования

1 × 10 ⁶ клеток BHK1E6 высевали на лунку в 6-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи.Клетки МТ-2 один раз промывали физиологическим раствором перед совместным культивированием 1 × 10 ⁶ клеток с предварительно засеянными клетками BHK1E6. Для первичных клеток CD4 ⁺ -pAB-D26 клетки центрифугировали 5 мин при 1500 об / мин и добавляли среду RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и 100 Ед интерлейкина-2 в разведении 1 × 10 ⁶ клеток / мл и добавлен к клеткам BHK1E6. Совместно культивируемые клетки не обрабатывали или обрабатывали 1 мкМ цитарабином в течение 24 часов. Супернатанты собирали для анализа с помощью анализа захвата антигена p19 Gag, и клетки дважды промывали PBS, фиксировали в 4% PFA в течение 20 минут и окрашивали набором β-галактозидазы (каталожный номер: 35001, активный мотив) в соответствии с производителями. протокол и инкубировали в течение ночи при 37 ° C.После этого клетки дважды промывали PBS, синие клетки оценивали с помощью световой микроскопии. Количественное определение TNT клеток BHK1E6 в совместном культивировании с клетками MT-2; 5000 клеток BHK1E6 высевали в µ-лунки, предварительно покрытые фибронектином, и инкубировали в течение ночи перед добавлением 20 000 клеток MT-2 без или с 1 мкМ цитарабина или 10 мкМ AZT (азидотимидин, зидовудин) в течение 24 часов. Все эксперименты выполнены в двух экземплярах и независимо повторены трижды. Количественное определение TNT клеток BHK1E6 или MT-2; 10 000 клеток BHK1E6 или 70 000 клеток MT-2 высевали в отдельные лунки без или с обработкой 1 мкМ цитарабином.Клетки фиксировали 4% PFA в течение 20 мин перед исследованием под микроскопом.

Для совместного культивирования клеток BHK1E6 и первичных CD4 ⁺ -pAB-D26 5000 клеток BHK1E6 высевали в µ-лунки, предварительно покрытые фибронектином (IBIDI), за один день до добавления клеток CD4 ⁺ pAB-D26. . Клетки CD4 ⁺ -pAB-D26 окрашивали синим CMAC (7-амино-4-хлорметилкумарин, 25 мкМ), как описано ранее ^⁴⁹. 20000 клеток CD4 ⁺ pAB-D26, окрашенных синим цветом, добавляли к клеткам BHK1E6 и культуральную среду, подходящую для клеток CD4 ⁺ -pAB-D26, использовали для совместного культивирования с добавлением 1 мкМ цитарабина или 10 мкМ AZT.Клетки фиксировали и окрашивали, как описано, клетками МТ-2 после 24 ч совместного культивирования.

Для совместного культивирования клеток MT-2 и THP-1-memGFP 56 000 клеток MT-2 и 14 000 клеток THP1-memGFP высевали на 8 мкл IBIDI, предварительно покрытые фибронектином. Все эксперименты независимо повторяли трижды.

p19 Анализ захвата антигена Gag

Вкратце, супернатанты от клеток собирали и центрифугировали при 1800 об / мин в течение 5 минут при комнатной температуре. Супернатанты переносили в свежую пробирку для сбора и хранили при -80 ° C до дальнейшего анализа.Gag p19 измеряли с помощью анализа ELISA с захватом антигена p19 Gag в соответствии с инструкциями производителя (ZeptoMetrix, Buffalo, NY).

Иммуноблоттинг

Клетки лизировали в буфере RIPA в течение 10 минут на льду перед центрифугированием 15 минут при 12000 об / мин при 4 ° C, и 40 мкг белка обычно загружали в трис-глициновые гели SDS. Электрофорез выполняли при 150 вольт в течение 1 часа и влажном блоттинге в течение 1 часа при 100 вольт или полусухим блоттингом в течение 7 минут в смешанном диапазоне (Thermo-fisher). Мембраны блокировали 5% BSA TBS-TWEEN в течение 1 ч и инкубировали с первичными антителами при 4 ° C в течение ночи, затем промывали TBS-TWEEN, инкубировали со вторичными антителами hrp-goat-anti-mouse / rabbit (1: 1000) в течение 1 ч при RT.Затем мембраны промывали два раза TBS-TWEEN и один раз TBS перед проявлением с помощью хемилюминесцентного субстрата pico / pico plus / femto (Thermo Fisher) и проявили в цифровом виде с использованием цифрового проявителя ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences) или ChemidocTM. Система MP Imaging (Bio-Rad) с использованием Image Lab 5.0 (Bio-Rad, 2013) для анализа изображений. Антитела для иммуноблоттинга: Tax (Tab172, 1: 100), HTLV-1 p24Gag (ABL inc., 1: 1000), COXIV (Abcam, 1: 2500), анти-HA (Cell Signaling Technologies, 1: 1000), β -актин (Abcam, 1: 1000), β-тубулин (Abcam, 1: 500).

Секвенирование Orf-I

Секвенирование Orf-I выполняли, как описано ранее ^³⁶ с небольшими изменениями.

Собирали приблизительно 1 × 10 ⁶ клеток и экстрагировали ДНК с использованием мини-набора QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Фрагмент ДНК, покрывающий orf-I , амплифицировали с помощью ПЦР с использованием Platinum PCR SuperMix (Invitrogen) с праймерами (p12-F: 5′-CACCTCGCCTTCCAACTG-3 ‘, p30-R: 5′-GGAGTATTTGCGCATGGCC-3′) и 300 нг геномная ДНК.Реакцию ПЦР проводили с использованием машины для градиентной ПЦР Eppendorf Master Cycler в течение 35 циклов; 94 ° C в течение 30 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд и 68 ° C в течение 50 секунд. Продукт ПЦР очищали с использованием набора для очистки Qiaquick PCR (Qiagen) и 50 нг ДНК вместе с 0,64 пикомоля праймера (5’-CTGGACAGGTGGCCAGTA-3 ‘) использовали для секвенирования. Секвенирование по Сэнгеру проводили в ядре геномики CCR в NCI, NIH.

Jurkat-memCherry-

orf-I клетки

Плазмида, экспрессирующая лентивирусный GFP pSDM-N26 (p8) -HA или pSDM-G29S (p12) -HA, была клонирована в pSDM101 ^⁸¹ (впоследствии pSDM) ПЦР-амплификация (p12-PmeI-F: 5 ‘— ATTAGTTTAAACGCCACCATGCTGTTTCGCCTTC-3′ и p12-BamHI-R 5 ‘— ATTAGGATCCCTAGAAGAGGGAAGCC12 из плазмы p12-BamHI-R — ATTAGGATCCCTAGAAGAGGGAAGCC12, ранее экспрессировавшаяся из плазмы p12-GATCCCTAGAAGAGGGAAGCC12, ранее экспрессировавшейся в плазме p12-BamHI-R0273- ATTAGGATCCCTAGAAGAGGGAAGCC2 описали ^{³⁵, ³⁶}, расщепленные ферментами рестрикции PmeI и Bamh2 и повторно клонированные в вектор pSDM, расщепленный pmeI и Bamh2.Все конструкции были проверены секвенированием. Чашку 10 см с 60–80% конфлюэнтными клетками 293FT трансфицировали с использованием реагента для трансфекции PEI (Polyscience Inc), куда добавляли 400 мкл DMEM без FBS, 12 мкг pSDM, pSDM-N26 (p8) -HA или pSDM-G29S (p12). -HA, 8 мкг psPAX-2 (упаковочная плазмида, Addgene) и 6 мкг pMD2.G (Env, Addgene). Далее, 26 мкл PEI (2 мг / мл) разбавляли в 400 мкл DMEM без FBS перед объединением с раствором ДНК, встряхивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут перед добавлением в 10-сантиметровую чашку с клетками 293FT в 10 мл. полная среда.Затем клетки инкубировали в течение 8 часов, после чего среду заменяли 8 мл свежей полной среды и культивировали еще 48 часов.

Супернатант клеточной культуры клеток 293FT центрифугировали в течение 5 минут при 1500 об / мин, а затем фильтровали через фильтр 0,22 мкм. После этого следовало центрифугирование при 8000 RCF (центрифуга Eppendorf 5418R) в течение 3 часов при 4 ° C и удаление всего супернатанта, кроме 20 мкл. Концентрированный вирус ресуспендировали в 100 мкл RPMI-1640 без FBS. Клетки Jurkat-memCherry центрифугировали при 1200 об / мин в течение 5 минут, ресуспендировали в растворе вируса, инкубировали в течение 5 минут при 37 ° C перед центрифугированием в течение 10 минут при 800 RCF.Наконец, клетки ресуспендировали в 1 мл полной среды в 12-луночном планшете в течение 72 часов. Эффективность трансдукции измеряли с помощью проточной цитометрии (FACSCalibur, BD).

Получение и характеристика первичных HTLV-1 клеток человека: CD4

⁺ -pAB-D26

Стабильные HTLV-1, продуцирующие 729,6 лимфобластоидных B-клеток человека, были получены, как описано ранее ^³⁷. Линия В-клеток 729-6, инфицированная вирусом дикого типа pAB, поддерживалась в среде RPMI 1640 с 10% FBS.Используя гранулы отрицательной селекции (StemCell), CD4 ⁺ Т-клетки выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров. Стабильные линии Т-клеток CD4 ⁺, продуцирующие HTLV-1, были созданы путем совместного культивирования неинфицированных донором первичных Т-клеток HLA.A2 + / CD4 ⁺ со смертельно облученными γ-излучением 729,6-HTLV-1 инфицированными клетками. Т-клетки культивировали в RPMI с добавлением 20% FBS и 100 Ед интерлейкина-2 в течение нескольких месяцев. Вирусные геномные последовательности подтверждены секвенированием фрагмента ClaI-SalI, как описано ранее ^³⁶.

Фенотипирование клеток CD4

⁺ HTLV-1

Клетки CD4 ⁺ -pAB-D26 HTLV-1, окрашенные антителами анти-CD3 (Alexa Fluor 700), анти-CD4 (перидинин хлорофилловый белок [PerCP] -Cy5.5), анти-CD8 (Qdot 655), анти-CD20 (Qdot 605), все получены от BD Biosciences и дополнительно окрашены фиксируемым красителем живых / мертвых мертвых клеток воды (Molecular Probes).

Экстракция ДНК

CD4 ⁺ Клетки HTLV-1 подвергали экстракции геномной ДНК.Геномную ДНК выделяли с использованием набора DNeasy для крови и тканей (Qiagen). ПЦР-амплификацию выполняли с использованием 100 нг ДНК со следующими праймерами gag-F1 (5-GGCCAAATCCTTTCC CGTAG-3) и gag-R1 (5′-GTTGTGGATTGTTGGCTTGG-3 ‘), β-actin-F1 (5’-CGGTTGGGCCTTAGGG ‘) И β-актин-R1 (5′-ATCGTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’). Ампликоны правильного размера идентифицировали электрофорезом в 1% агарозном геле.

Количественное определение провирусной ДНК HTLV-1

Провирусную нагрузку HTLV-1 измеряли в Т-клетках CD4 ⁺ HTLV-1 с помощью количественной ПЦР в реальном времени с использованием зонда TaqMan, как описано ранее ^⁸² с небольшими модификациями.Геномную ДНК экстрагировали с помощью мини-набора для крови QIAGEN (QIAGEN) и подвергали ПЦР. Число копий HTLV-1 измеряли с помощью праймеров для области pX HTLV-1. Ген РНКазы P, обнаруженный с помощью набора реагентов TaqMan RNase P Control (Applied Biosystems), использовали в качестве эндогенного эталона в мультиплексных реакциях. Нагрузка провирусов (%) была показана как число копий HTLV-1 на 100 копий гена РНКазы P.

Микроскопия

Использовались флуоресцентный микроскоп AxioObserver Z1, широкоугольный деконволюционный микроскоп Delta Vision Elite и конфокальный микроскоп LSM780 (Carl Zeiss, Inc, Торнвуд, Нью-Йорк).Alpha Plan Apochromat 63X / 1.4 NA Oil DICIII и соответствующие наборы фильтров для AxioObserver Z1 и Alpha Plan Apochromat 63X / 1.46 NA Oil. Лазеры: 25 мВт аргон 488, 20 мВт диодный лазер 561 нм для LSM780. Изображения были проанализированы с помощью программного обеспечения ZEN 2012. Для сканирующей электронной микроскопии изображения были получены Jeol JSM-7400F LEI 4,0 кВ, x3000 (x3700 для D2) и WD 8,0 мм. Рисунки были созданы с использованием программного обеспечения Photoshop CS6 и Zen (Carl Zeiss). Для трехмерного построения ImageJ 1.51k (Национальный институт здравоохранения (NIH)) использовался на Z-стеках (срезы 1 мкм) с использованием настроек по умолчанию для плагина 3D-проекта, включая наиболее яркую точку в качестве метода проецирования с вращением оси Y.Изображения были подготовлены с использованием Adobe Photoshop CS6 и Adobe Illustrator CS6.

Статистический анализ

Непарный t-критерий был проведен для оценки статистически значимых изменений. F-тест был проведен для проверки того, что индивидуальные вариации не были значительными. Использовалась GraphPad Prism (версия 6.03) (* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001).

Электронный дополнительный материал

Благодарности

Конфокальная микроскопия была проведена в центре флуоресцентной визуализации NCI Core, и мы благодарны за помощь доктору Др.Татьяна Сергеевна Карпова. Получение изображений с помощью сканирующей электронной микроскопии было выполнено в Центре молекулярной визуализации (MIC) при поддержке Департамента биомедицины и факультета медицины и стоматологии Университета Бергена и его партнеров. Мы благодарны за помощь Энди Сприет и Энн Карин Нюхауг за помощь в подготовке образцов для сканирующего электронного микроскопа. Мы благодарим Андре Сулена за помощь в сортировке THP-1-memGFP и Jurkat-memCherry положительных клеток. Эта работа была поддержана: Программой внутренних исследований Национальных институтов здоровья, Национальным институтом рака, Центром исследований рака и федеральными фондами Национального института рака, Национальных институтов здоровья (М.О., CPM, DF, CF, RPW, GF), Бергенский исследовательский фонд, Бергенский университет (Вирджиния), Бергенский университет (Миссури), гранты на поездки от: MedIm и исследования онкологических заболеваний, Бергенского университета и Норвежского общества инженеров и технологов (NITO), Норвежский институт биомедицинских наук (МО), Норвежское онкологическое общество с наследием Solveig & Ole Lunds и Фонд клинических исследований Эйвинна Мёльбаха-Петерсенса (грант № 104712, 145268, 145269 и 163424) (BTG ).

Вклад авторов

M.О. и В.А .: разработали и провели исследование, проанализировали данные и написали статью. R.W.P. провели анализ p19 Gag. C.P.M., D.F. и К.Ф. секвенировал orf-I и сгенерировал лентивирусные векторы, разработал исследования, проанализировал данные и написал статью. V.G .: провел анализ p19 Gag и сгенерировал первичные клетки CD4 ⁺ D26 и проверил их. B.T.G. и Г.Ф .: разработали исследование, проанализировали данные и написали статью. Все авторы рецензировали рукопись.

Примечания

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Сноски

Дополнительные электронные материалы

Дополнительная информация прилагается к этому документу по адресу 10.1038 / s41598-018-29391-w.

Примечание издателя: Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и принадлежностей организаций.

Список литературы

1. Gallo RC. Первый ретровирус человека. Sci Am. 1986; 255: 88–98. DOI: 10.1038 / Scientificamerican1286-88. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3.Poiesz BJ, et al. Обнаружение и выделение частиц ретровируса типа C из свежих и культивированных лимфоцитов пациента с кожной Т-клеточной лимфомой. Proc Natl Acad Sci USA. 1980; 77: 7415–7419. DOI: 10.1073 / pnas.77.12.7415. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Гессейн А. и др. Антитела к человеческому Т-лимфотропному вирусу типа I у пациентов с тропическим спастическим парапарезом. Ланцет. 1985; 2: 407–410. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (85) 92734-5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Осаме М. и др.Связанная с HTLV-I миелопатия, новое клиническое явление. Ланцет. 1986; 1: 1031–1032. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (86) -5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Нисиока К. и др. Хроническая воспалительная артропатия, связанная с HTLV-I. Ланцет. 1989; 1: 441. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (89)

-X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Eguchi K, et al. Первичный синдром Шегрена с антителами к HTLV-I: клинико-лабораторные особенности. Ann Rheum Dis. 1992; 51: 769–776. DOI: 10.1136 / ard.51.6.769. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10.Морган О.С., Роджерс-Джонсон П., Мора С., Чар Дж. HTLV-1 и полимиозит на Ямайке. Ланцет. 1989; 2: 1184–1187. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (89) -5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Alais S, Mahieux R, Dutartre H. Независимая от вирусного источника высокая восприимчивость дендритных клеток к инфекции вируса Т-клеточного лейкоза человека типа 1 по сравнению с инфекцией Т-лимфоцитов. J Virol. 2015; 89: 10580–10590. DOI: 10.1128 / JVI.01799-15. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. де Кастро-Амаранте М.Ф. и др.Заражение трех подгрупп моноцитов вирусом Т-клеточного лейкоза человека типа 1 вносит вклад в вирусную нагрузку у людей. J Virol. 2015; 90: 2195–2207. DOI: 10.1128 / JVI.02735-15. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Hanon E, et al. Фратрицид среди CD8 (+) Т-лимфоцитов, естественно инфицированных Т-клеточным лимфотропным вирусом человека типа I. Иммунитет. 2000. 13: 657–664. DOI: 10.1016 / S1074-7613 (00) 00065-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Knight SC, Macatonia SE, Cruickshank K, Rudge P, Patterson S.Дендритные клетки при инфекции ВИЧ-1 и HTLV-1. Adv Exp Med Biol. 1993; 329: 545–549. DOI: 10.1007 / 978-1-4615-2930-9_91. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Koyanagi Y, et al. In vivo инфицирование вирусом Т-клеточного лейкоза человека типа I в не-Т-клетках. Вирусология. 1993; 196: 25–33. DOI: 10.1006 / viro.1993.1451. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Longo DL, et al. Выделение HTLV-трансформированного клона B-лимфоцитов от пациента с HTLV-ассоциированным взрослым Т-клеточным лейкозом. Природа. 1984. 310: 505–506.DOI: 10.1038 / 310505a0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Macatonia SE, Cruickshank JK, Rudge P, Knight SC. Дендритные клетки пациентов с тропическим спастическим парапарезом инфицированы HTLV-1 и стимулируют пролиферацию аутологичных лимфоцитов. AIDS Res Hum Retroviruses. 1992; 8: 1699–1706. DOI: 10.1089 / help.1992.8.1699. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Mann DL, et al. Идентификация вируса Т-клеточной лимфомы человека в линиях В-клеток, полученных от пациентов с Т-клеточным лейкозом взрослых.J Clin Invest. 1984; 74: 56–62. DOI: 10.1172 / JCI111418. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 19. Нат, доктор медицины, Рускетти, Ф.В., Петров-Садовски, К.С., Джонс, К.С. Регулирование экспрессии на клеточной поверхности связывающего HTLV-I белка в человеческих Т-клетках во время иммунной активации. Кровь. 2003. 101: 3085–3092. DOI: 10.1182 / кровь-2002-07-2277. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Ричардсон Дж. Х., Эдвардс А. Дж., Крукшанк Дж. К., Радж П., Далглиш А. Г.. In vivo клеточный тропизм вируса Т-клеточного лейкоза человека 1 типа.J Virol. 1990; 64: 5682–5687. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 21. Сетояма М., Кердел Ф.А., Элгарт Дж., Канзаки Т., Бирнс Дж. Дж. Обнаружение HTLV-1 с помощью полимеразной цепной реакции in situ Гибридизация при Т-клеточном лейкозе / лимфоме взрослых. Am J Pathol. 1998. 152: 683–689. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 22. Сузуки М. и др. Экспрессия CD45RO на периферических лимфоцитах как прогностический маркер Т-клеточного лейкоза взрослых. Лимфома лейка. 1998. 28: 583–590. DOI: 10.3109 / 1042819980
67.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Ватанабе Т. Взрослый Т-клеточный лейкоз: молекулярная основа для клональной экспансии и трансформации Т-клеток, инфицированных HTLV-1. Кровь. 2017; 129: 1071–1081. DOI: 10.1182 / кровь-2016-09-692574. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Джонс К.С. и др. Молекулярные аспекты входа HTLV-1: функциональные домены поверхностной субъединицы HTLV-1 (SU) и их отношения с рецепторами входа. Вирусы. 2011; 3: 794–810. DOI: 10.3390 / v3060794. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25.Ghez D, Lepelletier Y, Jones KS, Pique C, Hermine O. Текущие концепции относительно рецепторного комплекса HTLV-1. Ретровирология. 2010; 7: 99. DOI: 10.1186 / 1742-4690-7-99. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Джонс К.С., Петров-Садовски С., Хуанг Ю.К., Бертолетт, округ Колумбия, Рускетти Ф.В. Бесклеточный HTLV-1 инфицирует дендритные клетки, приводя к передаче и трансформации CD4 (+) Т-клеток. Nat Med. 2008. 14: 429–436. DOI: 10,1038 / нм1745. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Dutartre H, Claviere M, Journo C, Mahieux R.Сравнение бесклеточной и межклеточной инфекции вирусом иммунодефицита человека типа 1 и Т-лимфотропным вирусом человека типа 1: изучение связи между источником вируса, распространением вирусов и репликацией вирусов. J Virol. 2016; 90: 7607–7617. DOI: 10.1128 / JVI.00407-16. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Rizkallah G, et al. Созревание дендритных клеток, но не воздействие интерферона I типа, ограничивает инфицирование HTLV-1 и передачу вируса Т-клеткам. PLoS Pathog. 2017; 13: e1006353. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1006353. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 30. Игакура Т. и др. Распространение HTLV-I между лимфоцитами за счет индуцированной вирусом поляризации цитоскелета. Наука. 2003; 299: 1713–1716. DOI: 10.1126 / science.1080115. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 32. Pais-Correia AM, et al. Подобные биопленкам внеклеточные вирусные сборки опосредуют передачу HTLV-1 от клетки к клетке в вирусологических синапсах. Nat Med. 2010; 16: 83–89. DOI: 10,1038 / нм.2065. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33.Фукумото Р. и др. In vivo генетические мутации определяют преобладающие функции белка p12I Т-клеточного лейкоза / вируса лимфомы человека. Кровь. 2009. 113: 3726–3734. DOI: 10.1182 / кровь-2008-04-146928. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34. Ван Проойен Н. и др. Белок вируса Т-клеточного лейкоза человека типа 1p8 увеличивает клеточные каналы и передачу вируса. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107: 20738–20743. DOI: 10.1073 / pnas.1009635107. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35.Фукумото Р. и др. Ингибирование передачи сигнала Т-клеточного рецептора и вирусной экспрессии линкером для активации взаимодействующего с Т-клетками белка p12 (I) вируса Т-клеточной лейкемии / лимфомы человека 1 типа. J Virol. 2007; 81: 9088–9099. DOI: 10.1128 / JVI.02703-06. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Валерий В.В. и др. Потребность в продуктах p12 и p30 вируса Т-клеточного лейкоза человека для инфекционности дендритных клеток человека и макак, но не кроликов. Кровь. 2010; 116: 3809–3817.DOI: 10.1182 / кровь-2010-05-284141. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38. Донхаузер Н., Хейм С., Тома-Кресс А.К. Количественное определение переноса белка HTLV-1p8 между Т-клетками с помощью проточной цитометрии. Front Microbiol. 2018; 9: 400. DOI: 10.3389 / fmicb.2018.00400. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Растом А., Саффрих Р., Маркович И., Вальтер П., Гердес Х. Х. Нанотубулярные магистрали для межклеточного транспорта органелл. Наука. 2004; 303: 1007–1010. DOI: 10.1126 / наука.1093133. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 40. Chauveau A, Aucher A, Eissmann P, Vivier E, Davis DM. Мембранные нанотрубки способствуют взаимодействию на больших расстояниях между естественными клетками-киллерами и клетками-мишенями. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107: 5545–5550. DOI: 10.1073 / pnas.04107. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 41. Онфельт Б, Недвецки С., Янаги К., Дэвис Д.М. Передний край: мембранные нанотрубки соединяют иммунные клетки. J Immunol. 2004. 173: 1511–1513. DOI: 10.4049 / jimmunol.173.3.1511.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 42. Osteikoetxea-Molnar, A. et al. . Детерминанты роста и транспортные свойства туннельных сетей нанотрубок между В-лимфоцитами. Cell Mol Life Sci , 10.1007 / s00018-016-2233-y (2016). [PubMed] 43. Евгенин Е.А., Гаскилл П.Дж., Берман Дж.В. Туннельные нанотрубки (TNT) индуцируются ВИЧ-инфекцией макрофагов: потенциальный механизм межклеточного трафика ВИЧ. Cell Immunol. 2009. 254: 142–148. DOI: 10.1016 / j.cellimm.2008.08.005. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 44.Hashimoto M, et al. Возможная роль образования туннельных нанотрубок в распространении ВИЧ-1 в макрофагах. J Immunol. 2016; 196: 1832–1841. DOI: 10.4049 / jimmunol.1500845. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 45. Okafo G, Prevedel L, Eugenin E. Туннельные нанотрубки (TNT) обеспечивают связь между щелевыми соединениями на больших расстояниях: последствия для клеток ВИЧ для распространения клеток. Научный доклад 2017; 7: 16660. DOI: 10.1038 / s41598-017-16600-1. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 46. Панасюк М., Рыхловский М., Derewonko, N. & Bienkowska-Szewczyk, K. Туннельные нанотрубки (TNT) как новый путь распространения вирусов герпеса от клетки к клетке. J Virol , 10.1128 / JVI.00090-18 (2018). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] 47. Робертс К.Л., Маникассами Б., Лэмб Р.А. Вирус гриппа A использует межклеточные связи для распространения на соседние клетки. J Virol. 2015; 89: 1537–1549. DOI: 10.1128 / JVI.03306-14. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 48. Sowinski S, et al. Мембранные нанотрубки физически соединяют Т-клетки на больших расстояниях, представляя новый путь передачи ВИЧ-1.Nat Cell Biol. 2008; 10: 211–219. DOI: 10,1038 / NCB1682. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 49. Omsland M, Bruserud O, Gjertsen BT, Andresen V. Образование туннельных нанотрубок (TNT) подавляется цитарабином и ингибированием NF-kappaB при остром миелоидном лейкозе (AML) Oncotarget. 2017; 8: 7946–7963. DOI: 10.18632 / oncotarget.13853. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 50. Sowinski S, Alakoskela JM, Jolly C, Davis DM. Оптимизированные методы визуализации мембранных нанотрубок между Т-клетками и переносом ВИЧ-1.Методы. 2011; 53: 27–33. DOI: 10.1016 / j.ymeth.2010.04.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 51. Miyoshi I, et al. Частицы вируса типа C в линии Т-клеток пуповины, полученные путем совместного культивирования нормальных лейкоцитов пуповины человека и лейкемических Т-клеток человека. Природа. 1981; 294: 770–771. DOI: 10.1038 / 294770a0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 52. Miyoshi I, et al. Трансформация нормальных лимфоцитов пуповины человека путем совместного культивирования со смертельно облученной линией Т-клеток человека, несущей вирусные частицы типа C. Ган.1981; 72: 997–998. [PubMed] [Google Scholar] 53. Бенард М. и др. Структурный и функциональный анализ туннельных нанотрубок (TnT) с использованием подходов gCW STED и gconfocal. Biol Cell. 2015; 107: 419–425. DOI: 10.1111 / boc.201500004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 54. Виттиг Д. и др. Многоуровневая связь пигментных эпителиальных клеток сетчатки человека через туннельные нанотрубки. PLoS One. 2012; 7: e33195. DOI: 10.1371 / journal.pone.0033195. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 56. Сприггс Д., Гриффин Дж., Виш Дж., Куфе Д.Клиническая фармакология малых доз цитозинарабинозида. Кровь. 1985; 65: 1087–1089. [PubMed] [Google Scholar] 57. Чан Дж. К., Грин WC. Динамические роли NF-kappaB в патогенезе ретровирусов HTLV-I и ВИЧ-1. Immunol Rev.2012; 246: 286–310. DOI: 10.1111 / j.1600-065X.2012.01094.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 58. Currer R, et al. HTLV tax: увлекательный многофункциональный сорегулятор вирусных и клеточных путей. Front Microbiol. 2012; 3: 406. DOI: 10.3389 / fmicb.2012.00406. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 59.Нагата К., Отани К., Накамура М., Сугамура К. Активация экспрессии эндогенного протоонкогена c-fos с помощью белка p40tax, кодируемого вирусом Т-клеточного лейкоза типа I, в линии Т-клеток человека, Jurkat. J Virol. 1989; 63: 3220–3226. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 60. Hase K и др. M-Sec способствует образованию мембранных нанотрубок, взаимодействуя с Ral и комплексом экзоцисты. Nat Cell Biol. 2009; 11: 1427–1432. DOI: 10,1038 / ncb1990. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 61. Astier-Gin T, Portail JP, Lafond F, Guillemain B.Идентификация клеток, продуцирующих HTLV-I или HTLV-II, путем совместного культивирования с клетками BHK-21, стабильно трансфицированными генной конструкцией LTR-lacZ. J Virol Methods. 1995; 51: 19–29. DOI: 10.1016 / 0166-0934 (94) 00097-Z. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 62. Hermine O, Ramos JC, Tobinai K. Обзор новых открытий в области Т-клеточной лейкемии-лимфомы у взрослых: Акцент на текущие и новые стратегии лечения. Adv Ther. 2018; 35: 135–152. DOI: 10.1007 / s12325-018-0658-4. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 63.Jaworski E, et al. Клетки, инфицированные человеческим Т-лимфотропным вирусом типа 1, секретируют экзосомы, содержащие белок Tax. J Biol Chem. 2014; 289: 22284–22305. DOI: 10.1074 / jbc.M114.549659. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 64. D’Aloia, A. et al. . RalGPS2 участвует в формировании туннельных нанотрубок в 5637 раковых клетках мочевого пузыря. Exp Cell Res , 10.1016 / j.yexcr.2017.11.036 (2017). [PubMed] 65. Ариази Дж. И др. Туннелирование нанотрубок и щелевых соединений — их роль в межклеточной коммуникации на большие расстояния во время развития, здоровья и болезней.Front Mol Neurosci. 2017; 10: 333. DOI: 10.3389 / fnmol.2017.00333. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 66. Burtey A, et al. Межклеточный перенос рецептора трансферрина по контактному, Rab8-зависимому механизму с участием туннельных нанотрубок. FASEB J. 2015; 29: 4695–4712. DOI: 10.1096 / fj.14-268615. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 67. Desir S, et al. Формирование туннельных нанотрубок стимулируется гипоксией в раковых клетках яичников. Oncotarget. 2016; 7: 43150–43161. DOI: 10.18632 / oncotarget.9504. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 68. Гуссе К. и др. Прионы захватывают туннельные нанотрубки для межклеточного распространения. Nat Cell Biol. 2009. 11: 328–336. DOI: 10,1038 / NCB1841. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 69. Паскье Дж. И др. Предпочтительный перенос митохондрий от эндотелиальных к раковым клеткам через туннельные нанотрубки модулирует химиорезистентность. J Transl Med. 2013; 11: 94. DOI: 10.1186 / 1479-5876-11-94. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 70. Саенс-де-Санта-Мария I и др.Контроль межклеточной коммуникации на большие расстояния и передачи аутофагосом при плоскоклеточном раке через туннельные нанотрубки. Oncotarget. 2017; 8: 20939–20960. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 71. Шерер Н.М. и др. Ретровирусы могут устанавливать филоподиальные мостики для эффективной передачи от клетки к клетке. Nat Cell Biol. 2007. 9: 310–315. DOI: 10,1038 / ncb1544. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 72. Хираива Н., Хираива М., Каннаги Р. Кодируемый вирусом-1 Т-клеточного лейкоза человека белок Tax трансактивирует альфа-1–> 3 фукозилтрансферазу Fuc-T VII, которая синтезирует сиалил-Льюис X, селектиновый лиганд, экспрессируемый на взрослых Т-клеточных лейкозных клетках.Biochem Biophys Res Commun. 1997. 231: 183–186. DOI: 10.1006 / bbrc.1997.6068. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 73. Джам, С. З. и Семмес, О. Дж. Инфекция HTLV-1 и Т-клеточный лейкоз у взрослых / лимфома — История двух белков: Tax и HBZ. Вирусы 8 , 10.3390 / v8060161 (2016). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] 74. Катаока К. и др. Комплексный молекулярный анализ Т-клеточного лейкоза / лимфомы взрослых. Нат Жене. 2015; 47: 1304–1315. DOI: 10,1038 / нг. 3415. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 75.Bazarbachi A, et al. Мета-анализ использования зидовудина и интерферона-альфа при Т-клеточном лейкозе / лимфоме у взрослых показывает улучшение выживаемости при лейкозных подтипах. J Clin Oncol. 2010. 28: 4177–4183. DOI: 10.1200 / JCO.2010.28.0669. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 76. Dassouki Z, et al. Ответ ATL на терапию мышьяком / интерфероном запускается SUMO / PML / RNF4-зависимой деградацией налога. Кровь. 2015; 125: 474–482. DOI: 10.1182 / кровь-2014-04-572750. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 77. Iwanaga M, et al.Провирусная нагрузка вируса Т-клеточного лейкоза типа I (HTLV-1) и прогрессирование заболевания у бессимптомных носителей HTLV-1: общенациональное проспективное исследование в Японии. Кровь. 2010; 116: 1211–1219. DOI: 10.1182 / кровь-2009-12-257410. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 78. Nagai M, et al. Анализ провирусной нагрузки HTLV-I у 202 пациентов с HAM / TSP и 243 бессимптомных носителей HTLV-I: высокая провирусная нагрузка сильно предрасполагает к HAM / TSP. J Neurovirol. 1998. 4: 586–593. DOI: 10.3109 / 135502898025. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 79.Эрикштейн Б.С. и др. Клеточный стресс, вызванный резазурином, приводит к аутофагии и гибели клеток за счет производства активных форм кислорода и нарушения митохондрий. J Cell Biochem. 2010; 111: 574–584. DOI: 10.1002 / jcb.22741. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 80. Лу Х и др. Налог снимает репрессию транскрипции, способствуя высвобождению гистондеацетилазы 1 из длинного концевого повтора вируса Т-клеточного лейкоза 1 типа. J Virol. 2004. 78: 6735–6743. DOI: 10.1128 / JVI.78.13.6735-6743.2004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 81. Chevalier SA, et al. Профиль транскрипции Tax-3 больше похож на Tax-1, чем Tax-2: понимание потенциальных лейкемогенных свойств HTLV-3. PLoS One. 2012; 7: e41003. DOI: 10.1371 / journal.pone.0041003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 82. Танака Г. и др. Клональная экспансия Т-клеток, инфицированных Т-лимфотропным вирусом человека 1-го типа: сравнение сероконвертеров и долгосрочных носителей. J Infect Dis.2005; 191: 1140–1147. DOI: 10,1086 / 428625. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
ESPN, Бока Хуниорс против Колона В РЕЖИМЕ ОНЛАЙН через TNT Sports и Fanatiz от Профессиональной лиги: телеканалы и передачи по дате 13 | Минута за минутой | Составы | СТРИМ HD LIVE через приложение без сокращений | ФУТБОЛ-ИНТЕРНЭШНЛ
Невозможно пропустить СЕГОДНЯ, Бока Хуниорс vs. Colon collide (LIVE | LIVE | ONLINE | FREE | TV) для 13-го дня Профессиональной лиги Аргентины 2021 года, в это воскресенье, 26 сентября, с 18:15 (по перуанскому времени и еще два в Аргентине).Следите за ОФИЦИАЛЬНОЙ трансляцией STREAM HD LIVE через ESPN, TNT Sports и Fanatiz для всей Латинской Америки, а также поминутно на веб-сайте Depor.com .
«Бока Хуниорс», которая в эту среду достигла мучительного выхода в полуфинал Кубка Аргентины, обыграв Патронато по пенальти и сравняв счет без голов, будет стремиться продлить свою удачную серию в это воскресенье, когда получит Колон де Санта Фе в Бомбонере.
Ксенеиз занимает восьмое место с 18 очками, на один меньше, чем у действующих чемпионов.«Бока Хуниорс» непобежден с тех пор, как тренером стал Себастьян Батталья с четырьмя победами и тремя ничьими.
У Колона на одно очко больше, чем у его соперника, он выиграл у «Централ Кордова» 1: 0 и хочет снова присоединиться к борьбе за титул.
Бока Хуниорс — Колон: расписание матчей и каналы
Мексика — 18:15 — Фанатиз
Перу — 18:15 — ESPN
Эквадор — 18:15 — ESPN
Колумбия — 6:15 стр.м. — ESPN
Боливия — 19:15 — ESPN
Венесуэла — 19:15 — ESPN
Парагвай — 19:15 — ESPN
Чили — 20:15 — ESPN
Аргентина — 20:15 — ESPN и TNT Sports
Уругвай — 20:15 — ESPN
Бразилия — 20:15 — NOW NET и Claro, GUIGO, Watch ESPN Brasil, ¿и ESPN Brasil
Испания — 1:15 (понедельник, 27 сентября) — Footters
После попадания в полуфинал Кубка Аргентины «Xeneize» будет стремиться продолжить добавление в Профессиональную лигу, где они находятся в девятой ячейке, с восемнадцатью единицами.
В последнем матче местного турнира «сине-золотые» обыграли «Атлетико Тукуман» 2: 1 и продлили свою серию из шести игр, не проигрывая, с четырьмя победами и двумя ничьими.
Что касается профессионального состава, то здесь есть перуанцы Луис Адвинкула и Карлос Самбрано. Тот, кого там не будет, — это Хуан Рамирес, у которого растяжение боковой боковой связки левого колена.
У руля будет Колон, чемпион Кубка профессиональной лиги 2021 года, который накануне обыграл «Централ Корбобу» (1: 0).
«Сабалеро» режиссера Эдуардо Домингеса идет в седьмом боксе с девятнадцатью частями.
Бока Хуниорс — Колон: вероятное совпадение
Бока Хуниорс: Агустин Росси, Луис Адвинкула, Карлос Искьердос, Маркос Рохо, Франк Фабра, Диего Гонсалес, Йорман Кампусано, Агустин Альмендра, Эдвин Кардона, Норберто Бриаско и Николас Орсини. DT: Себастьян Батталья.
Колон : Леонардо Буриан, Факундо Мура, Паоло Гольц, Бруно Бьянки, Рафаэль Дельгадо, Эрик Меза, Федерико Лертора, Родриго Алиендро, Кристиан Бернарди, Кристиан Феррейра и Факундо Фариас.DT: Эдуардо Домингес.
Получает наш информационный бюллетень : Мы будем присылать вам лучший спортивный контент, как всегда делает Depor.