Ирина пинчук инстаграм официальный сайт: Ирина Пинчук нарядила сына на прогулку в мятный комбинезон с ушками

Очищенный комплекс TcdB – CSPG4 ^ECD (35 мкл, 5 мкМ) был поперечно сшит 65 мМ DHSO и 65 мМ 4- (4,6-диметокси -1,3,5-триазин-2-ил) -4-метилморфолиния хлорид (DMTMM) в PBS (pH 7.4) в течение 1 ч при комнатной температуре с использованием протокола, описанного ранее ^48,49 . Полученные сшитые продукты были подвергнуты ферментативному расщеплению с использованием протокола FASP ⁵⁰ . Вкратце, сшитые белки переносили в Millipore Microcon Ultracel PL-30 (фильтры 30 кДа), восстанавливали / алкилировали и расщепляли Lys-C / трипсином, как описано ³² . Полученные гидролизаты обессоливали и фракционировали пептидом SEC ⁴⁹ . Фракции, содержащие DHSO-сшитые пептиды, собирали для последующего анализа LC MS ⁿ .Были выполнены три биологических повтора для получения данных с высокой воспроизводимостью поперечных сшивок.

LC MS

LC MS ⁿ анализ выполняли с использованием системы Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 в интерактивном режиме в сочетании с масс-спектрометром Orbitrap Fusion Lumos. Колонку Acclaim PepMap C18 размером 50 см × 75 мкм использовали для разделения пептидов в градиенте 1–25% ACN за 106 мин при скорости потока 300 нл / мин.Для максимальной идентификации пептидов, сшитых DHSO, использовались два различных метода сбора данных: (1) первые четыре зависящие от данных MS ³ и (2) целевое получение MS ³ , ​​оптимизированное для захвата сшитых DHSO пептидов посредством используя разность масс между характеристическими MS ² фрагмент-ионами DHSO-сшитых пептидов ( α — β ) (что Δ = α _T — α _A = β _T — β _A = 31.9721 Да) ⁵¹ .

Анализ данных и идентификация сшитых DHSO пептидов

MS ⁿ Извлечение данных и анализ выполняли, как описано ранее ^31,32 . Данные MS ³ были подвергнуты Protein Prospector (v.5.19.1) для поиска в базе данных с использованием Batch-Tag против пользовательской базы данных, содержащей девять записей о белках, соединенных с его случайной версией. Допуски по массе были установлены как ± 20 м.д. и 0,6 Да для исходного и фрагментного ионов, соответственно.Трипсин был установлен как фермент с тремя максимально допустимыми пропущенными расщеплениями. Карбамидометилирование цистеина было задано как фиксированная модификация. Различные модификации включали ацетилирование N-конца белка, окисление метионина и N-концевое превращение глутамина в пироглутаминовую кислоту. Кроме того, были выбраны три определенные модификации глутаминовой и аспарагиновой кислот, которые включали алкен (C ₃ H ₄ N ₂ ; +68 Да), сульфеновую кислоту (C ₃ H ₆ N ₂ SO; +118 Да) и тиол (C ₃ H ₄ N ₂ S; +100 Да), представляющие собой фрагменты поперечно-сшивающего фрагмента.Во время поиска разрешалось не более четырех модификаций данного пептида. Собственная программа Xl-tools использовалась для идентификации, проверки и обобщения сшитых пептидов на основе данных MS ⁿ и результатов поиска в базе данных ⁵¹ . После интеграции данных MS ^и не было идентифицировано никаких перекрестных связей с участием белков-ловушек. Сообщаются только сшитые пептиды, которые были идентифицированы во всех трех биологических повторностях.

Подготовка сетки для электронной микроскопии и получение изображений

Для сбора крио-ЭМ данных наносили 4 мкл очищенного комплекса TcdB ^core –CSPG4 ^mini в концентрации ~ 0.2 мг / мл для дырчатых углеродных решеток с тлеющим разрядом (Quantifoil Grid R2 / 2 Cu 200 меш). Сетки промокали в течение 1,5 с с использованием плунжера FEI Vitrobot при 10 ° C и 100% влажности, а затем погружали в жидкий этан, охлаждаемый жидким азотом. Два набора данных были собраны из двух сеток с использованием аналогичных параметров. Для обоих сборов данных крио-ЭМ визуализацию выполняли на электронном микроскопе Titan Krios, оборудованном прямым электронным детектором Gatan K3 и фильтром изображений Gatan Image Filter с шириной щели 20 эВ.Микроскоп работал при ускоряющем напряжении 300 кэВ при увеличении 105 кХ в режиме сверхвысокого разрешения, в результате чего размер пикселя составлял 0,415 Å. Все изображения были автоматически записаны с использованием SerialEM ⁵² . Для первого набора данных фильмы были получены при накопленной дозе 40 e- / Å ² с расфокусировкой в ​​диапазоне от -1,2 до -2,2 мкм. Для второго набора данных фильмы были получены при накопленной дозе 46 э- / Å ² с расфокусировкой в ​​диапазоне от -1,2 до -2,2 мкм. Общее время экспозиции составило 2.3 с более 66 кадров в стеке видеороликов. Мы заметили, что первый набор данных имел проблему предпочтительной ориентации во время обработки данных. Поэтому мы собрали второй набор данных, используя сетку с более толстым слоем льда, что дало больше частиц с лучшей ориентацией.

Обработка изображения и определение структуры

Все полученные фильмы подверглись исправлению движения и оценке CTF фрагмента в cryoSPARC v2. Частицы были автоматически отобраны с помощью сборщика капель в cryoSPARC. Следующие двухмерные, трехмерные классификации и уточнения были выполнены в cryoSPARC ⁵³ .Для каждого из двух наборов данных мы сначала извлекли частицы с размером блока 896 × 896 пикселей и разбили данные на 4. После раундов двухмерной классификации мы получили 559 247 хороших частиц путем слияния двух наборов данных, которые использовались для ab initio. реконструкция на пять классов с последующим неоднородным уточнением. Мы выбрали один из лучших классов с четкими характеристиками для однородной обработки. После неоднородного уточнения с последующим локальным уточнением с помощью маски мы получили карту с разрешением 3,37 Å, которая показывала общую форму комплекса TcdB ^core –CSPG4 ^mini .Точно так же мы также попытались использовать размер блока 576 × 576 пикселей и разделить данные на 3. После раундов 2D-классификации мы получили 560 946 хороших частиц путем объединения двух наборов данных, которые использовались для реконструкции ab initio в пять классов, с последующим дальнейшим гетерогенным уточнением. Мы выбрали один из лучших классов с четкими характеристиками и лучшим разрешением для однородной детализации. После неоднородного уточнения с последующим локальным уточнением с плотной маской, чтобы исключить очень гибкую область с низким разрешением, мы получили 3.Карта плотности с разрешением 17 Å, которая была увеличена с использованием локальной резкости в Phenix ⁵⁴ . Используя полноразмерную структуру TcdB в качестве входной модели, мы смогли построить модель для комплекса TcdB ^core –CSPG4 ^mini , ​​используя Phenix ⁵⁴ . Эта исходная модель структуры использовалась для итеративного ручного построения в Coot и уточнения реального пространства в Phenix ^54,55 . Рисунки были созданы с использованием PyMOL (Schrödinger) и химеры UCSF ⁵⁶ .

Анализ динамического светорассеяния

Динамическое рассеяние света (DLS) выполняли с использованием прибора Malvern Instruments Zetasizer Nano series, и данные анализировали с помощью Zetasizer Version 7.12 программ. Всего 100 мкл комплекса TcdB ^core –CSPG4 ^mini в концентрации 0,1 мг / мл анализировали при 25 ° C. Был представлен репрезентативный профиль DLS по трем аналогичным результатам.

Анализы биослойной интерферометрии (BLI)

Аффинности связывания между TcdB и Repeat1 измеряли с помощью анализа BLI с использованием OctetRED96 (ForteBio). Перед использованием биосенсоры замачивали в буфере для анализа (20 мМ HEPES, 400 мМ NaCl, pH 7,5, 10 мМ CaCl ₂ , 0,1% Tween-20, 0.5% BSA) не менее 10 мин. Вкратце, Repeat1-Fc (50 нМ) иммобилизовали на биосенсорах захвата (Dip and Read Anti-hIgG-Fc, ForteBio) и уравновешивали аналитическим буфером. Затем биосенсоры подвергали воздействию различных концентраций TcdB1 или TcdB2 с последующей диссоциацией в том же буфере для анализа. Аффинности связывания ( K _d ) рассчитывали с использованием модели связывания 1: 1 с помощью анализа данных ForteBio HT 10.0.

Для анализа конкуренции между безлотоксумабом и CSPG4 за связывание с TcdB, His-tagged Repeat1 (200 нМ), который был биотинилирован с использованием EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (Thermo Fisher Scientific) при pH 6.5 ¹⁰ , ​​иммобилизовали на биосенсорах захвата (Dip and Read Streptavidin, ForteBio) и уравновешивали аналитическим буфером. Биосенсоры сначала подвергали воздействию TcdB1 или TcdB2 (200 нМ) соответственно, а затем уравновешивали аналитическим буфером. Затем биосенсоры наносили на безлотоксумаб (200 нМ) с последующей диссоциацией в буфере для анализа. Наоборот, безлотоксумаб (200 нМ) иммобилизовали на биосенсорах захвата (Dip and Read Anti-hIgG-Fc, ForteBio) и уравновешивали аналитическим буфером.Биосенсоры сначала подвергали воздействию TcdB1 или TcdB2 (200 нМ) соответственно, а затем уравновешивали аналитическим буфером. Затем биосенсоры наносили на CSPG4 ^mini (200 нМ) с последующей диссоциацией в буфере для анализа.

Анализ плавления белков и эксклюзионная хроматография

Термическую стабильность вариантов TcdB1 измеряли с использованием анализа теплового сдвига на основе флуоресценции на аппарате для ПЦР в реальном времени StepOne (Life Technologies). Каждый белок (~ 0,5 мг / мл) смешивали с флуоресцентным красителем SYPRO Orange (Sigma-Aldrich) и нагревали от 25 до 95 ° C в линейном режиме.Середину кривой плавления белка ( T _m ) определяли с использованием программного обеспечения для анализа, предоставленного производителем прибора. Данные, полученные в трех независимых экспериментах, были усреднены для создания гистограммы. Сворачивание вариантов Repeat1-Fc подтверждали эксклюзионной хроматографией Superdex-200.

Pull-down анализы

Для исследований мутагенеза на основе структуры взаимодействия между TcdB и CSPG4 были изучены с использованием анализов pull-down с использованием протеина A или смол Strep-Tactin в связывающем буфере, содержащем 20 мМ HEPES, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl ₂ и 0,1% Твин-20. При тестировании вариантов TcdB Repeat1-Fc использовался в качестве приманки, а варианты TcdB (WT и мутанты) были жертвами. Repeat1-Fc (45 мкг) предварительно инкубировали со смолами с протеином А при комнатной температуре в течение 1 ч, и несвязанный белок смывали с использованием связывающего буфера. Затем смолы делили на небольшие аликвоты и смешивали с вариантами TcdB (~ 4-кратный молярный избыток по сравнению с Repeat1-Fc). Анализы с понижением температуры проводили при комнатной температуре в течение 3 часов.Затем смолы дважды промывали, и связанные белки высвобождали из смол путем кипячения в загрузочном буфере SDS-PAGE при 95 ° C в течение 5 минут. Аналогичный протокол был использован для изучения взаимодействия между вариантами Repeat1-Fc (жертвы) и TcdB1, меченным Twin-Strep (приманка), иммобилизованным на смолах Strep-Tactin, а также одновременного связывания Repeat1-Fc и CRD2 (жертвы) с Twin-Strep, помеченный TcdB1 (приманка). CRD2 экспрессировали и очищали, как описано ранее ²⁴ . Образцы анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим.

Конкуренция между безлотоксумабом и CSPG4 при связывании с TcdB была исследована с помощью двухэтапных анализов с понижающим преобразованием с использованием протеина A или смол Strep-Tactin. В первой серии экспериментов безлотоксумаб служил приманкой, TcdB1 или TcdB2 были добычей на первом этапе, а CSPG4 ^mini — на втором этапе. В частности, безлотоксумаб (40 мкг) предварительно инкубировали со смолами с протеином А при 12 ° C в течение 1 ч и несвязанный белок смывали. Связанные безлотоксумабом смолы затем делили на небольшие аликвоты и смешивали с ~ 2-кратным молярным избытком TcdB1 или TcdB2, а несвязанные токсины смывали через 2 ч инкубации при 12 ° C.Наконец, в каждую пробирку добавляли CSPG4 ^mini (~ 4-кратный молярный избыток по сравнению с безлотоксумабом) или пустой связывающий буфер. После инкубации при 12 ° C в течение 2 часов смолы дважды промывали и связанные белки нагревали, высвобождая из смол при 95 ° C в течение 5 минут, а затем исследовали с помощью 4–20% SDS-PAGE.

Во второй серии экспериментов 20 мкг меченного биотином CSPG4 ^mini использовали в качестве приманки и предварительно инкубировали со смолами Strep-Tactin при 12 ° C в течение 1 часа. Несвязанный белок смывали, а затем смолы, связанные с CSPG4 ^mini , ​​разделяли на небольшие аликвоты.TcdB1 или TcdB2 (~ 2-кратный молярный избыток по сравнению с CSPG4 ^mini ) были жертвами на первом этапе, а безлотоксумаб (~ 4-кратный молярный избыток по сравнению с CSPG4 ^mini ) был жертвой на втором этапе. Двухэтапные анализы с понижающим преобразованием проводили с использованием протокола, аналогичного описанному выше.

Все исследования на животных проводились в соответствии с этическими нормами и протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Института при детской больнице Бостона (18-10-3794R).Модель инфекции Clostridioides difficile была описана ранее ⁵⁷ . Мыши C57BL / 6 были первоначально приобретены у Charles River, и колония была создана в той же комнате, где содержались мыши CSPG4 KO (но две линии не содержались совместно в одной клетке). Мыши CSPG4 KO были получены из лаборатории доктора Уильяма Столлкапа ³⁶ . Вкратце, мышей (6-8 недель, самцов и самок) кормили смесью антибиотиков в воде в течение 3 дней (канамицин (0,4 мг / мл), гентамицин (0.035 мг / мл), колистин (850 Ед / мл), метронидазол (0,215 мг / мл) и ванкомицин (0,045 мг / мл)). Затем мышей кормили обычной водой в течение 1 дня и внутрибрюшинно вводили (внутрибрюшинно) однократную дозу клиндамицина (10 мг / кг). Через день после инъекции клиндамицина животных заражали контрольным PBS или спорами C. difficile (1 × 10 ⁵ или 1 × 10 ⁴ на мышь) и контролировали дважды в день в течение 48 часов. Были зарегистрированы такие симптомы, как диарея, потеря веса и изменения поведения ³⁵ .Животных умерщвляли с помощью удушья CO ₂ , когда животные были в состоянии смерти; или животные имели потерю веса более 15% веса тела. Всех живых мышей через 48 часов умерщвляли для сбора тканей слепой и толстой кишки, которые подвергали окрашиванию либо гематоксилином и эозином (H&E) для гистологического анализа, либо иммунофлуоресцентному окрашиванию на клаудин-3.

Получение

Получение спор C. difficile было описано ранее ⁵⁸ .Вкратце, C. difficile извлекали из морозильной камеры при -80 ° C со средой Brain Heart Infusion (Fischer Scientific) плюс 5% дрожжевой экстракт (BD Difco) и культивировали в течение 24 часов при 37 ° C в анаэробной камере до стационарного состояния. фаза. Затем культуру C. difficile распределяли по чашкам 70:30 ⁵⁹ с помощью ватного тампона. Споры собирали и очищали 50% этанолом после 14-дневного роста и споруляции и замораживали при -80 ° C для хранения.

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) для гистологического анализа и иммунофлуоресцентное окрашивание

H&E и иммунофлуоресцентное окрашивание были описаны ранее ²⁴ .Вкратце, ткани слепой или толстой кишки промывали PBS до полного удаления фекального содержимого. Ткани фиксировали в 10% забуференном фосфатом формалине в течение 24 часов, заливали парафином и делали срезы по 6 мкм каждая. Гистологический анализ проводили с окрашиванием H&E. Окрашенные срезы оценивались двумя наблюдателями, не относящимися к экспериментальным группам, на основании четырех критериев, включая инфильтрацию воспалительных клеток, геморрагический застой, разрушение эпителия и подслизистый отек по шкале от 0 до 3 (нормальный, легкий, умеренный или тяжелый).Общие гистологические баллы складывались из баллов по четырем критериям. Иммунофлуоресцентный анализ клаудина-3 проводили с использованием кроличьих поликлональных антител против клаудина-3 (Abcam, ab15102, 1: 100). Изображения были получены с помощью микроскопа Olympus IX51 (программное обеспечение cellSens standard 1.15) и микроскопии Zeiss (программное обеспечение Zen 2.5).

Анализ цитопатического округления клеток

Цитопатический эффект (округление клеток) WT и мутантного TcdB анализировали с помощью стандартного анализа округления клеток. Вкратце, клетки подвергали воздействию градиента мутантов TcdB и TcdB в течение 6 и 24 часов.Были получены фазово-контрастные изображения клеток (Olympus IX51, объективы × 10–20). Количество клеток округлой и нормальной формы подсчитывали вручную. Процент клеток круглой формы был нанесен на график и подогнан с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. CR ₅₀ определяется как концентрация токсина, которая вызывает округление 50% клеток за 24 часа. Данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение от трех независимых биологических повторов.

Анализ связывания с клеточной поверхностью

Связывание WT и мутированного TcdB с клетками анализировали с помощью анализа связывания с клеточной поверхностью ²¹ .Вкратце, клетки подвергали воздействию мутантов TcdB (10 нМ) или TcdB (10 нМ) в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки промывали трижды PBS и лизировали буфером RIPA (50 мМ Трис, 1% NP40, 150 мМ NaCl, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, смесью ингибиторов протеаз (Sigma-Aldrich). Лизаты клеток центрифугировали и супернатанты подвергали вестерн-блоттингу с использованием куриных поликлональных антител против TcdB IgY (List Labs, # 754A, 1: 2000) и козьих антител против куриных IgY H&L (HRP) (Abcam, ab97135, 1: 2000) для исследования связывания TcdB. мутанты.Поликлональные куриные поликлональные антитела против актина (Aves Labs, ACT-1010, 1: 2000) использовали в качестве отрицательного контроля.

Анализ инъекции слепой кишки

Токсичность in vivo WT и мутировавшего TcdB проверяли с помощью анализа инъекции слепой кишки ²⁴ . Вкратце, мышей (CD1, 6-8 недель, самцы и самки, приобретенные у Envigo) голодали 19 часов, а затем глубоко эстетизировали 3% изофлураном. Была выполнена лапаротомия по средней линии, и 100 мкл PBS, TcdB (6 мкг) или мутанта TcdB (6 мкг) были введены через илеоцекальный клапан в просвет слепой кишки через инсулиновый шприц (31G).Разрез закрыли рассасывающейся нитью (Викрил 5-0). Слепую кишку собирали после 6-часового периода восстановления. Ткани фиксировали в 10% формалине, заливали парафином, делали срезы и подвергали либо окрашиванию H&E для гистологического анализа, либо окрашиванию иммунофлуоресценцией на клаудин-3.

Анализ защиты in vitro

Эффективность защиты in vitro ингибиторов проверяли с помощью цитопатического эффекта округления. Вкратце, TcdB1 (10 пМ) или TcdB2 (100 пМ) предварительно инкубировали с двукратными серийно разведенными ингибиторами в среде DMEM (с 3 мМ CaCl ₂ ) при 37 ° C в течение 2 часов.Затем клетки подвергали воздействию токсина или смеси токсин-ингибитор в течение указанного времени. Были получены фазово-контрастные изображения клеток (Olympus IX51, объективы × 10–20). Количество клеток округлой и нормальной формы подсчитывали вручную. Процент клеток круглой формы был нанесен на график и подогнан с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение от трех независимых биологических повторов.

Анализ защиты in vivo

Эффективность защиты in vivo ингибиторов проверяли с помощью анализа инъекции слепой кишки.Вкратце, TcdB1 (6 мкг) и TcdB2 (6 мкг) были предварительно смешаны с Repeat1-Fc (30 мкг) или безлотоксумабом (52 мкг). Контрольный PBS, токсин, токсин с Repeat1-Fc или безлотоксумабом или контроль Repeat1-Fc вводили в соединительную часть между подвздошной и слепой кишкой после голодания и анестезии мышей CD1. Ткань слепой кишки животных собирали после 6-часового восстановления и подвергали окрашиванию H&E для гистологического анализа.

Количественное определение колониеобразующих единиц (КОЕ) во время инфекции

КОЕ / г фекалий C.difficile и титр TcdB / г фекалий инфицированных мышей были количественно определены ⁵⁹ . Вкратце, мышей кормили водой с антибиотиком в течение 3 дней. Регулярная поливка была возобновлена ​​в течение 1 дня, а затем внутрибрюшинно. инъекция одной дозы клиндамицина (10 мг / кг). спор C. difficile (1 × 10 ⁴ на мышь) вводили через пероральный желудочный зонд через 24 часа после инъекции клиндамицина. Фекалии собирали (через 24, 48 и 72 ч после заражения), взвешивали и немедленно замораживали при -80 ° C до готовности к использованию.Для подсчета КОЕ кал полностью растворяли в 500 мкл PBS плюс 500 мкл 95% этанола и находили в течение 1 ч при комнатной температуре. Растворенные фекалии затем серийно разбавляли и высевали на отобранные чашки C. difficile (CHROMID ^® C. DIFFICILE, BioMérieux). Споры C. difficile инкубировали 24 часа при 37 ° C в анаэробных условиях, и КОЕ подсчитывали вручную и стандартизировали на грамм фекалий.

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне исследований доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.

Джон Хелмер — Инсайдер

Джон Хелмер — самый продолжительный непрерывно работающий иностранный корреспондент в России и единственный западный журналист, который руководит своим собственным бюро независимо от национальных или коммерческих связей. Впервые он создал свое бюро в 1989 году, что сделало его сегодня старейшиной корпуса иностранной прессы в России.

У его семьи много связей с Россией. Отцом-основателем был солдат из Дании в Великой армии Наполеона, который в 1812 году решил, что его шансы на выживание будут выше, если он не попытается составить компанию Наполеону по возвращении домой.Остальные члены семьи были убиты немцами во время вторжения в Советский Союз в 1941 году.

Хелмер родился и получил образование в Австралии, затем в Гарвардском университете. Он также был профессором политологии и советником глав правительств Греции, США и Азии. Он первый и единственный член администрации президента США (Джимми Картер), обосновавшийся в России.
Он регулярно выступает по русской тематике в Китае, Западной Европе и США, а также на конференциях, организованных CRU, Центром технологий управления, ярмаркой в ​​Виченце (Италия) и другими отраслевыми конвенциями.

До России Хелмер издал в США несколько книг на военную и политическую тематику. Очерки американского президентства и городской политики в США были опубликованы в сборниках книг в 1981 и 1982 годах; очерки о политике Греции и Ближнего Востока в период с 1986 по 1989 год. С 1989 года он публиковался почти исключительно на российские темы.

Сегодня Хельмер является одним из самых читаемых российских специалистов в деловом мире благодаря своим сенсационным материалам о российских цветных и драгоценных металлах, алмазах, добыче, судоходстве, страховании, торговле продуктами питания и деловой политике.Он является аккредитованным корреспондентом Business Day и Weekender в Южной Африке и единственным репортером российских новостей в Африке.

«Я хочу, чтобы фанаты всегда двигали нас вперед! Дмитрий — тихий инстаграм-игрок.

Обычно новости об игроках «Факела» беспокоят в основном болельщиков команды. Но недавно защитник воронежского клуба 24-летний Дмитрий Тихий оказался в центре внимания журналистов. Неделю назад во многих СМИ появилась информация о том, что ради футболиста из телепроекта ушла участница реалити-шоу «Дом-2» Ирина Пинчук.Ирине 21 год, многие поклонники реалити-шоу называли ее самой красивой участницей. История с футболистом воронежской команды быстро обросла слухами. Корреспонденты «МЧС!» Созвонился с Дмитрием и поговорил с ним о том, как он познакомился со звездой «Дом-2», чем ему запомнилась первая половина сезона Национальной футбольной лиги и каковы шансы «Факела» на выход в Премьер-лигу.

«Ира покорила меня улыбкой»

Ирина Пинчук из Брянской области.Девушка участвовала в шоу «Остров любви» в рамках проекта «Дом-2» с 7 сентября 2016 года до начала декабря. Съемки проходили на Сейшельских островах. Ира на острове познакомилась со своим избранником Иваном Барзиковым и создала с ним пару. По результатам зрительского голосования Ирина и Иван стали лучшей парой и выиграли миллион. Однако практически сразу после победы молодые люди поссорились и расстались. Но, несмотря на разногласия, у Ирины были хорошие перспективы на проекте. А через некоторое время ведущий проекта Влад Кадони объявил, что Ира уходит из шоу «ради футболиста Димы», которым оказался защитник «Факела» Дмитрий Тихий.Ира объявила о своих новых отношениях в Instagram. Периодически девушка вместе с Димой устраивает видеочаты, где отвечает на вопросы поклонников. Однако о личной жизни ребята предпочитают не говорить.

— Нас часто спрашивают, как мы познакомились … С помощью социальных сетей, — сказал Дима в интервью. — Я видела Иру в Instagram в рубрике «Интересное». Ира покорила меня своей красивой улыбкой. Я написал и начал общаться. Я не хочу раскрывать какие-либо подробности наших отношений.Все получилось, и вот мы вместе. Мы поговорили с ней и решили, что будет лучше, если она уйдет из телепроекта. Мне с ней комфортно и прекрасно.

На вопрос, беспокоит ли его популярность Иринина, Дмитрий отвечает, что Дом-2 не смотрел и его не беспокоит то, что было у Пинчука до встречи с ним. Сейчас футболисты «Факела» в отпуске, 16 января команда приступит к тренировкам. Дмитрий отдыхает в Москве с семьей и девушкой.

— Ира готова к переезду? Мы обсудили это и решили, что когда сезон продлится, она уедет в Воронеж, — говорит Дмитрий. — Раньше Ира никогда не смотрела футбол. Но куда она денется, теперь она будет ходить на игры и болеть за меня.

Кстати, сестра Дмитрия Тихого участвовала в проекте ТНТ «Танцы». Речь идет об Анне Тихой, которой в первом сезоне проекта удалось выйти практически в финал. Дима говорит, что некоторым движениям его учит сестра.Но когда ребята просят познакомить его с Аней, Дмитрий отказывается, говорит, что он ревнивый брат.

«Люблю Воронеж за болельщиков»

До прихода в «Факел» Дмитрий играл во Владивостоке за Луч-Энерджи, затем в Премьер-лиге за Владикавказскую Аланию. В одном из матчей он получил серьезную травму — разрыв крестообразной связки, долго восстанавливался. И сразу после реабилитации в 2014 году ему предложили сыграть за «Факел». К сожалению, эта летне-осенняя часть чемпионата сложилась для Дмитрия не совсем удачно.Весной в конце прошлого сезона футболист получил травму — снова разрыв крестообразной связки, но уже на другой ноге. Защитник не выходил на поле полгода.

— Восстановление после операции прошло хорошо, — сказал Дмитрий. — У меня не в первый раз была такая травма, я уже знал, что меня ждёт. Я чувствую себя хорошо, меня ничего не беспокоит. А мою форму должны оценивать и главный тренер, и болельщики, которые наблюдают за моей игрой со стороны. Впереди сборы в январе, и я надеюсь, что быстро наберу форму.

— Если подвести итоги первой части чемпионата, какая игра запомнилась больше всего?

— Думаю, не только мне, но и болельщикам запомнится игра с московским «Динамо». Мы выиграли дома 2: 1. Ажиотаж на стадионе был невероятным. Я считаю, что это лучшая игра сезона.

— Болельщики «Факела» давно мечтали, чтобы команда наконец добралась до Премьер-лиги. Есть ли у игроков такая цель для себя?

— Конечно, мы хотим перейти в Премьер-лигу.Хочу самореализоваться, поднять свой уровень. Но, к сожалению, не все зависит от игроков. Для выхода в Премьер-лигу нужно подходить более комплексно, потребуется другое финансирование и инфраструктура. Пока только об этом говорят. Со своей стороны, мы сделаем все, что в наших силах, чтобы порадовать болельщиков. Сейчас «Факел» занимает пятое место в турнирной таблице. Уверен, что мы вполне способны побороться за 3-е и 4-е места, чтобы сыграть в плей-офф и выйти в Премьер-лигу.

— Кто из игроков является для вас примером, на кого вы особенно ориентируетесь?

— Если вы посмотрите на позицию защитника, в которой я играю, то мне нравится Серхио Рамос из «Реала». Для меня в мировом футболе это эталон защитника. В чемпионате России меня очень впечатлил правый защитник Марио Фернандес из ЦСКА.

— За два года вы привыкли к Воронежу?

— Да, мне город очень нравится.У меня мало времени гулять, но я стараюсь ходить в кино, я фанат кино, не пропускаю ни одной премьеры. И больше всего мне нравится Воронеж из-за болельщиков, которые ходят на стадион. Я очень рад, что столько людей интересуются футболом. Играя за «Факел», мне приходили предложения от других клубов, но команда меня устраивает, именно с ними я хотел бы выйти в Премьер-лигу.
(второй слева Дмитрий)

Следующую половину сезона «Факел» начнет с тренировок на своей базе в Тенисте, а затем отправится на сборы в Сочи.Первая игра футболистов состоится 8 марта на домашнем стадионе с командой СКА-Хабаровск. Надеемся, что в Новом году «Факел» ждут только победы.

Она покинула скандальный телепроект Дом-2 в середине декабря 2016 года. Уход Ирины из Дома-2 стал неожиданностью для многих участников и зрителей. Все знали, что Пинчук какое-то время находился в подавленном состоянии из-за расставания с Иваном Барзиковым. И уж точно никто не ожидал, что она скоро покинет популярное ток-шоу.Оказалось, что девушка была далеко не в депрессии, а в ожидании чего-то нового в своей жизни.

Незадолго до принятия решения об уходе из телепроекта Ирина Пинчук познакомилась с российским футболистом Дмитрием Тихим. 24-летний спортсмен отправил Пинчуку шикарные букеты роз и небольшие подарки. В один прекрасный день Дмитрий предложил девушке попрощаться с реалити-шоу «Дом-2» и построить отношения вне проекта. На тот момент Ирина должна была поехать с некоторыми парами на Сейшелы, куда она, в принципе, планировала поехать.Однако в самый последний момент участница передумала и сообщила ведущей о своем уходе из Дома-2.

Сегодня Ирина по-прежнему в паре с Дмитрием Тихим. Новый год 2017 влюбленные выехали в Индию в Гоа. Недавно в эфире «Дом-2» Ольга Бузова сообщила о расставании Пинчука с футболистом, но сами супруги эту информацию не подтвердили. Более того, четыре дня назад Дмитрий опубликовал на своей странице в инстаграм совместное фото с Ириной.

Попрощавшись, Ирина продолжает вести активный образ жизни. Девушку приглашают на различные фотосессии. Последний был в свадебном стиле. Пинчук поделилась с подписчиками снимками в социальных сетях, на которых запечатлена в белоснежном свадебном платье. В этом наряде Ирина Пинчук выглядит не просто невестой, а настоящей принцессой.

Ирина также приняла участие в новогодних фотосессиях, где ее наряды сменились с черных оттенков на ярко-красные.

Ирина понравилась поклонникам с первого дня его участия в шоу «Остров любви», они искренне переживают за ее личную жизнь и надеются, что на этот раз ее отношения сложатся. быть более успешным.

Бывшая участница «Дома-2» Ирина Пинчук стала одной из немногих, кто покинул проект ради любви за периметром. Многие участники не афишируют, но помимо «дома» у них есть отношения вне телевизора.

Ира не смогла отказаться от своих принципов и, чтобы не лгать себе и не вводить в заблуждение других, покинула телешоу. Барышня возмущалась, закатывала истерики, принимала неверные решения, но на камеру не играла.

Детство и юность

Будущая звезда скандального реалити-шоу родилась 11 февраля 1995 года в крохотном городке Унеча (Брянская область). Мать Инна и отец Евгений с детства окружали любимую дочь вниманием и заботой.Из биографии звезды известно, что у семьи Иры был средний доход. Но, несмотря на это, девушке старались ни в чем не отказывать. Родители воспитывали добродушную Иру исключительно «пряником», «кнута» в ее жизни никогда не было.

В школе жизнерадостная брюнетка не упускала случая проявить себя. Девушка снималась в сценах, играла в КВН и 4 года ходила в театральный коллектив. Заветной мечтой юной леди была актерская карьера.

Проблема заключалась в том, что неугомонной очаровательной женщине всегда было трудно долго сидеть за книгами и скрупулезно читать текст.Не имея возможности поступить в желаемый вуз, Ире не пришлось выбирать.

Будущая звезда «Дом-2» окончила Технологический институт по специальности «Товароведение и экспертиза качества товаров народного потребления». Кстати, сама Пинчук неоднократно заявляла, что получила образование «для галочки» и не намерена связывать жизнь с товароведением.

В целом экс-участница не боялась работы и с юных лет стремилась к финансовой независимости.Так, с раннего возраста (13 лет) девушка разносит газеты, продает одежду на местном рынке, а с 18 лет работает продавцом-консультантом. Но вскоре тупость и рутина, окутавшие Ирину, стали причиной нервных срывов. Решив коренным образом изменить свою жизнь, Пинчук собирает вещи и уезжает в Дом-2.

«Дом 2»

В анкете, которую заполняют все желающие попасть на телевизор, Ира написала, что ищет мужчину «для извращений».Такое заявление не могло остаться незамеченным, и 7 сентября 2016 года яркая брюнетка становится участницей скандального телепроекта Дом-2: Остров любви. Пинчук в компании 12 девушек прилетел на Сейшелы, чтобы бороться за сердце заядлого холостяка — и. Скромная девушка с хорошенькими чертами лица и очаровательной улыбкой сразу становится любимицей обоих женихов.

Изначально Ира отдала предпочтение Ивану Барзикову. Но привыкший к женскому вниманию парень не спешил обременять себя серьезными отношениями, флиртуя со всеми невестами по очереди.Не привыкшая к статусу «одна из» Пинчук после шумной вечеринки в отместку ловеласу объявила себя парой с Александром Задойновым.

Как барышня не пробовала, сердце не прикажешь. Через пару дней роковая красавица осознала, что, находясь рядом с Александром, ее мысли всецело занят Иваном. Барышня рассталась с Задойновым и стала слезно умолять Ивана дать их отношениям второй шанс. Молодой человек простил изменщика, и пара воссоединилась.

Зрители, давно следящие за проектом, знали, что ревнивый Иван никогда не забудет измены, и при каждой ссоре Пинчук будет вспоминать ее «ошибку». Несмотря на недоверие пары, молодым людям удалось выйти в финал и выиграть на свадьбу миллион.

После острова ребята вернулись на поляну. Как выяснилось позже, парень действительно не прощал Ирине измены, и оскорбление, которое разрушало его изнутри, ежедневно вырывалось шквалом критики и жалоб.Как и ожидали телезрители, тандем Барзикова и Пинчука распался.

Перед уходом девушка, стоя на коленях, попросила у мачо проекта прощения за недостойное поведение. Она 3 раза предлагала Ивану все забыть и начать строить отношения с нуля, но парень был непреклонен и остался верен своему решению.

Личная жизнь

В начале декабря 2016 года на официальном сайте проекта появилась новость о том, что любимица телезрителей Ирина Пинчук больше не является участницей телешоу.Причиной ухода стал роман с футболистом воронежского факела Дмитрием Тихимом.

Молодые люди познакомились в тот момент, когда Иван Барзиков поставил жирную точку в отношениях с девушкой. Ирина была в декадентском настроении и, пытаясь отвлечься от тягостных мыслей, согласилась на встречу с 24-летним парнем, который подолгу писал ей в Директ (Instagram).

В ходе разговора выяснилось, что футболист уезжает на отдых через пару дней, а сама Пинчук одновременно летит на Сейшелы.Вскоре Ирине дается еще один выходной, чтобы барышня основательно готовилась к островам.

Молодые люди снова встречаются. Дима сообщает, что произошла путаница с билетами, и он никуда не летит. К разочарованию красавицы, с ее билетами был полный порядок. В жанре лучших мелодрам за 10 часов до вылета участница рейтинга сообщает организаторам, что покидает проект, и новообразованная пара встречает новый 2017 год в Индии, в Гоа.

На сегодняшний день известно, что Дима увез Ирину в Воронеж, где после проекта девушка поселилась в своей квартире.

Ирина Пинчук сейчас

До того, как попасть на телеканал, эффектная брюнетка жила в Брянске и работала продавцом, но с детства мечтала о славе: играла в КВН, училась в театральной студии.

Ее небольшой родной город не позволил реализовать ее творческие амбиции, и в 2016 году Ирина отправилась на кастинг Дом-2.

Девушка попала на Сейшелы и долго не могла определиться, кем из закоренелых холостяков — Александром Задойновым или Иваном Барзиковым — она ​​хочет быть. Ирина сделала свой выбор в пользу Ивана и выиграла с ним миллион рублей на свадьбу, но брак не состоялся.

Экс-арендатор завела Instagram и рассказывала фанатам о своей жизни, снимая видео и отвечая на вопросы.

К сожалению, через год роман со спортсменкой закончился, и Пинчук вернулся в Дом-2, чтобы во второй раз попытать счастья.

Ирина Пинчук до и после пластической операции

После ухода из телепроекта Ирина резко похудела, а вместе с 8 килограммами исчезли привлекательные формы.

Брюнетка не приняла такую ​​ситуацию и сделала маммопластику. Она тщательно отобрала своего пластического хирурга и осталась очень довольна результатом увеличения груди. В марте 2018 года Ирина показала поклоннику новый образ, опубликовав горячие фото в Instagram.Фолловеры оценили изменения и отметили, что бюст очень естественный и сексуальный.

На фото Ирины Пинчук до и после пластической операции видно, как изменился стиль в одежде: теперь она предпочитает платья с глубоким вырезом.

После второго появления на проекте участники и зрители заметили, насколько красивее и свежее стала Ира за время ее отсутствия. Возможно, для того, чтобы засиять на экране, ей сделали «уколы красоты» и сделали курс мезотерапии.

Некоторые поклонники считают, что пухлые и четко очерченные губы звезды с ровным контуром — результат введения филлеров. Но сравнение фотографий показывает, что подозрения беспочвенны.

Личная жизнь Ирины Пинчук

Вернувшись на проект летом 2018 года, Ирина начала строить отношения с Романом Гриценко, который долгое время проявлял признаки внимания к Ольге Бузовой.

Молодой человек никак не определяет свои чувства и доводит обеих девушек до слез.Из-за этого Пинчук подумывала снова уйти из реалити-шоу, но пока решила воздержаться от поспешных решений.

Участница шоу продолжила совершенствовать свой образ. Она эпилировала верхнюю губу, чтобы избавиться от пистолета, над которым смеялись.

Девушка сменила прическу и превратила прямые черные волосы в крутые локоны. По словам поклонников, эксперимент оказался неудачным и испортил качество волос.

Хотя Пинчук дорожит вниманием и любовью подписчиков и телезрителей, по внешнему виду она никого не слушает и придерживается своего стиля.

Фото: vk.com/pinchulli, www.instagram.com/pinchuk_official, vk.com/dom2