Иосиф оганесян в контакте дом 2: Саша Черно оригинально поздравила Оганесяна с 30-летием

Третье место

Лойола 69, Редондо 46

Пятое место

Палисейдс 59, Лонг Бич Джордан 56

Седьмое место

Инглвуд 65, Нарбонн 46 9102

, Gardena 44
Fountain Valley 65, Redondo frosh 63
Canoga Park 57, Culver City 49
Crossroads 55, Morningside 42

Все турниры: MVP Джош Шипп (Фэрфакс), самый выдающийся Райан Ховард (епископ Монтгомери), Д’Андре Белл (палисады), Терренс Харрис (LB Jordan), Джордан Уилкс (Лойола), Винс Оливер (Лойола), Чаз Логан (Редондо), Остин Отри (епископ Монтгомери), Брэндон Гамильтон (епископ Монтгомери), Джамал Бойкин (Фэрфакс), Аарон Белл (Фэрфакс).

RIVERSIDE POLY
Round Robin

Claremont 71, Canyon Springs 61
Jordan Block набрал 30 очков, включая восемь трехочковых, за Claremont (2-0).

Corona Centennial 72, Elsinore 55
Джастин Уильямс набрал 17 очков и 14 подборов и возглавил Corona Centennial (2-0). Эльсинор — 0: 1.

САН-ДИЕГО ФРАНСИС ПАРКЕР
Чемпионшип

Фрэнсис Паркер 95, Мерфи 81
Шон Каннингем набрал 45 очков, 15 подборов, семь передач и семь перехватов, что позволило Мёрфи вести (3-1).

САУГУС
Бронзовый дивизион
Чемпионат

Окснард 71, Саугус 64
Центровой Генри Паттерсон, который был назван самым ценным игроком турнира, набрал 18 очков и 10 подборов, что позволило Окснарду (4: 0) завоевать титул. Дэвид МакГрат добавил 18 очков и 11 подборов, а Алан Лоттинвилл набрал 16 очков, четыре перехвата и четыре передачи. Согус — 3-1.

Третье место

Джефферсон 85, Вердуго Хиллз 63
Остин Ашер набрал 33 очка, а Кун Уилсон прибавил 26 для Джефферсона (1-3).Джои Темпл и Крис Мартин набрали по 14 очков за Вердуго Хиллз (1-5).

СЕРРАНО
Чемпионшип

Сильверадо 62, Арлингтон 57
Джейми Лестер набрал 19 очков за посещение Сильверадо (4-0). Арлингтон — 3: 1.

SILVER VALLEY
Championship

Granite Hills 88, Hesperia Christian 71
Эндрю Эллис, MVP турнира, набрал 25 очков, а Рори Хилл набрал 19 очков и 11 подборов для Granite Hills (3-0).Марио Мауну, финишировавший с четырьмя перехватами и семью очками в субботней стрельбе 3 из 4, также прошел олл-турнир. У Джоша Хэмилтона, который также прошел олл-турнир, было 24 очка, чтобы опередить Hesperia Christian (2-1).

Третье место

29 Palms 72, Silver Valley 67
У Майка Ашера было 27 очков, восьмерки и семь перехватов, и он получил награду All-Touranment за 29 Palms (2-1). Сидней Тарп добавил 22 очка в «Серебряную долину», забив 14 трехочковых корзин.

SIMI VALLEY
Championship

Simi Valley 66, Ventura 54
Джон Шок набрал 19 очков и 20 подборов, а Марк Уэллс прибавил 15 очков, чтобы опередить Simi Valley (4-0).Уэллс и Шок были названы со-MVP турнира. Вентура — 3-1.

Третье место

Валенсия 70, Оук Парк 48

Пятое место

Монро 72, Рио-Меса 42

Седьмое место

Камарилло 69, Гранада Хиллз

Кэмпбелл Холл 50, Голливуд 47
Джейсон Херд набрал 19 очков, чтобы опередить Кэмпбелл Холл (3-0).Голливуд 2-1.

Оукс Кристиан 60, Креспи 48

Утешение

Блэр 51, Пасифик Хиллз 36
Дамиан Илий набрал 16 очков в пользу Блэра (2-1). Пасифик Хиллз — 1-2.

Гранада Хиллз Хиллкрест Кристиан 63, Монклер Подготовка 44
Дрю Ригни набрал 23 очка за Хиллкрест Кристиан.

Fairmont Prep 63, USC MaST 50
Saddleback Valley Christian 58, La Verne Lutheran 21

CERRITOS / GAHR
Полуфиналы

Downey 64, Cerritos 62
Millikan 60, Mayfair 58 9109

Вестчестер 72, Брентвуд 43
Маркус Джонсон возглавил Вестчестер (1: 0) с 11 очками.

LOARA
Первый раунд

Трой 52, Уоррен 40
Первокурсник Дерек Беркли набрал 14 очков и 10 подборов, а Брайан Грэм имел 13 очков и 13 подборов, что привело Троя (1: 0).

МИССИЯ ВИЕХО
Бильярд

Эльдорадо 54, Оранж 29
Питу Бонду было 13 очков, чтобы опередить Эльдорадо (2: 0), который сделал 18 из 20 штрафных бросков. Оранжевый падает до 0-2.

Миссия Вьехо 64, Лагуна Хиллз 42
Тим Алеринг набрал 10 очков и 10 подборов, а Перри Вебстер сделал счет с девятью очками и семью передачами за Миссию Вьехо (2: 0), которая проиграла со счетом 25-24 в перерыве.

REDONDO TOURNAMENT
Первый раунд

Fairfax 103, Canoga Park 48
Новобранец Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе Джош Шипп набрал 40 очков, шесть перехватов, пять передач и восемь подборов для Fairfax (1-0) в начале сезона. Джамал Бойкин добавил «Львов» 20 очков.

Long Beach Jordan 79, Gardena 51
Inglewood 76, Redondo (JV) 56
Loyola 69, Crossroads 46

SAN GORGONIO
Pool play

San Gorgonio 78, Chaffey 53
San Gorgonio (led Ryan Sherman) 1: 0) с 18 очками в первом матче сезона против Чаффи (0: 1).

Темескал Каньон 87, Гесперия 35
Мэтт Нунуз набрал 23 очка и 10 подборов, а Брайан Берд добавил 16 очков и 9 подборов и возглавил Темескал Каньон (1: 0). Гесперия — 0: 1.

Redlands East Valley 111, Kaiser 82
Темекула-Вэлли 63, Valley View 45

SAUGUS
Pool Play

Oxnard 75, Verdugo Hills 37
Окснард вышел в лидеры 20-6 в первой четверти. Старший центровой Генри Паттерсон возглавил «Окснард» (1: 0) с 20 очками и тремя блокировками.

SIMI VALLEY
Первый раунд

Камарилло 79, Санта-Паула 36
Бретт Скиферс набрал 25 очков, а Эрик Смит добавил 12 очков для Камарилло (1-0).

Оук Парк 61, Беверли-Хиллз 42
Блейк Уайлдт набрал 22 очка и 11 подборов за Оук Парк (1-0).

Рио-Меса 61, Сан-Вэлли Поли 42
С помощью пяти трехочковых Эндрю Кронин набрал все 19 очков во втором тайме, что помогло Рио-Меса (1: 0) выйти из первого сезона для обеих команд.

Сими Вэлли 64, Санта-Клара 42
У Марка Уэллса было 20 очков и 11 подборов, а у Джона Шока 19 очков за Сими Вэлли (1-0).

Вентура 66, Бербанк Берроуз 47
У Дэвида Викселла было 19 очков, а у Колина Кэмпбелла было семь подборов за Вентуру (1-0).

Monroe 80, Newbury Park 68
Granada Hills 60, Royal 54
Valencia 59, El Camino Real 49

WESTERN
Pool play

Damien 46, Rancho Alamitos 45
Rancho Alamitos (1-1) последний второй выстрел, сохранивший победу Дэмиена (1-0).

НЕЛИГА

Болдуин Парк 70, Ла Пуэнте 32
Эрик Эстрада набрал 22 очка, а Дж. Р. Наварро добавил 19 очков за посещение Болдуин Парка (1: 0).

Белл Гарденс 62, Ла Серна 58
Терренс Джойнер набрал 21 очко, включая пять трехочковых, чтобы опередить Белл Гарденс (1: 0), отставание от которого на половине матча составляло 24–42. Хозяин Ла Серна начинает 0: 1.

Бонита 42, Сан-Димас 37
Бонита (1: 0) выросла на 17 очков в перерыве между таймами, но проиграла 17: 2 в третьей четверти, прежде чем устояла перед победой.

Cantwell Sacred Heart 68, Webb 64
Мэтт Перес набрал 31 очко, а J.J. ДеЛагарза добавил 20 очков в игру Cantwell Sacred Heart (1-0). Дональд Митчелл возглавил Уэбба (0: 1) с 20 очками.

Карпинтерия 45, Санта-Инес 42
Джулиан Лопес набрал 17 очков и четыре штрафных броска на последней минуте игры, закрепив за собой победу Карпинтерии (1: 0).

Сенчури 58, Лагуна Бич 44
Эрик Сея возглавил хозяйку Сенчури (1: 0) с 20 очками и 8 подборами.Лагуна Бич падает до 0-2.

Community Harvest Charter 65, Wildwood 30
Джошуа Рой из Community Harvest (2-0) возглавил всех игроков с 17 очками.

First Lutheran 71, L.A. Lutheran 52
Дэвид Старк набрал 24 очка, а Крис Адамс добавил 22, что привело к победе First Lutheran в открытии сезона для обеих команд.

Глендора 77, Роуленд 55
Дэвон Робертс набрал 28 очков, а Джеймс Пауэлл добавил 18, что привело к победе хозяина турнира Глендора (1: 0).

Керн Вэлли 40, Тафт 31
Джейк Колек набрал 12 очков, четыре передачи и четыре перехвата, а Роберт Леминг добавил 11 очков, семь подборов и четыре перехвата и возглавил Керн Вэлли (1: 0).

Лос-Анджелес Баптист 63, Долина Серритос Кристиан 54
Скотт Стурценакер набрал 25 очков за посещение Баптиста из Лос-Анджелеса (1: 0).

Либерти Кристиан 60, Пионер Баптист 37
Натан Уилсон набрал 26 очков и 16 подборов, а Брэд Киттингер скинул счет с 16 очками за Хозяина Либерти Кристиана (1-0).

Маутейн Вью 55, Бассет 43
Виктор Рамирес набрал 25 очков, включая четыре трехочковых, чтобы опередить в гостях в Маунтин-Вью (1-0). Бассет — 0-1.

Ньюпорт Харбор 72, Лома Линда Академия 40
Крис Пурдом возглавил Академию Лома Линда с 25 очками, но этого было недостаточно, чтобы победить, посетив Ньюпорт Харбор, в начале сезона для обеих команд.

Риальто 79, Пасифик 75 (ОТ)
Ламарк Милан набрал 25 очков и 10 подборов в гостях у Риальто (1: 0).

Сэдлбэк Вэлли Кристиан 44, Истсайд Кристиан 30
Брайан Харбин набрал 13 очков, а Кевин Фернандес — 11 очков и сделал 13 подборов в гостях у Сэдлбэка Вэлли Кристиана (1-0). Истсайд Кристиан — 1: 1.

Sage Hill 49, Rio Contiguo 36
Кевин Джойс возглавил Sage Hill (2: 0) с 19 очками.

Сан-Габриэль 65, Сан-Марино 62
Эндрю Вайс набрал 20 очков в проигрыше на открытии сезона хозяину Сан-Марино.

Санта-Мария-Сент-Джозеф 65, Пасо Роблес 54
Джо Тилли набрал 28 очков и возглавил «Сент-Джозеф» (1: 0). Пасо Роблес — 0: 1.

Шурр 52, Эль Ранчо 44
Майкл Хамнер набрал 22 очка и сделал шесть подборов, выйдя вперед Шурра в гостях (1: 1).

Сент-Джон Боско 64, Калифорния 57
Майк Дэвис набрал 12 очков и 11 подборов, а Кертд Элисальдес добавил девять очков, девять передач и три перехвата, чтобы возглавить гости на Сент-Джон Боско в открытии сезона для обеих команд.Алек Стерн возглавил всех игроков с 29 очками за Калифорнию.

Сент-Маргарет 54, Чедвик 30
Пол Янчик набрал 16 очков и сделал 11 подборов, выйдя вперед у хозяина Сент-Маргарет (1: 0).

Тарбут В ‘Тора 64, Голгофа Баптист 38
Джейми Стопницкий сделал 12 из 19 бросков и закончил с 29 очками, опередив хозяина Тарбут В’ Тора (2: 0).

Таузенд Оукс 55, Сан-Маркос 52
Тайлер Карр набрал 12 очков и сделал 11 подборов, выйдя впереди Таузенд Оукс в первом сезоне для обеих команд.

Вествью 66, Глендейл Адвентист 57
Эбби Бенсон набрал 31 очко и 14 подборов, опередив Вествью (1: 0) над Адвентистом из Глендейла (0: 1).

Аквинский 49, Большой Медведь 42
Чартерный Дуб 62, Ногалес 46
Эль-Монте 46, Азуза 36
Лос-Пинос 66, Академия Зинсмейера 50
Розамонд 60, Пустыня Ланкастер Кристиан 45
Уитни 57, Академия Орангвуда 48

Понедельник, 1 декабря

ТУРНИРЫ

BEAUMONT
Первый раунд

Arroyo Valley 73, Hemet 61
Clyde Williams набрал 18 очков, а Ethraim Williams добавил 17 очков и 18 подборов для Arroyo Valley .Райан Прифер набрал 17 очков за Хемета (0: 1).

BUENA PARK
Pool play

Bolsa Grande 57, Katella 51
Sale Лауматия набрала 15 очков и девять подборов, а Джесси Родригес с 12 очками за Bolsa Grande (1-0). У Михаэля Ибанеза было 21 очко за Кателлу (0: 1).

Garden Grove Pacifica 54, El Modena 32
Sunny Hills 60, Lakewood 49
Tesoro 77, Magnolia 40

LOARA
First Round

Northwood 79, Loara 68
Sonora 42, Dana Hills 40

MOS
Pool Play

Gardena Serra 68, Wilmington Banning 35
Джозеф Джонсон набрал 25 очков и шесть передач за Serra (1-0).

Peninsula 71, Lawndale 14
Курт Грэбер набрал 16 очков за Peninsula, который лидировал со счетом 37-10 в перерыве между таймами на Mira Costa High. Игра открыла сезон для обеих школ.

Линвуд 57, Южный Торранс 50
Мира Коста 76, Сент-Моника 30

МИССИЯ VIEJO
Пул

Эльдорадо 61, Оушенсайд 35
У Пита Бонда 14 очков и 6 подборов, а у Кита Черри 10 Очки и шесть передач за Эльдорадо (1-0).Оушенсайд — 0: 1.

Вудбридж 76, Оранж 24
Дэвид Берджесс набрал 16 очков и 12 подборов, обогнав Вудбриджа (1: 0).

REDONDO
Первый раунд

Бишоп Монтгомери 60, Фаунтин Вэлли 33
Брэндон Гамильтон набрал 11 очков и 13 подборов за Бишопа Монтгомери (1-0), который после перерыва обошел Фаунтин Вэлли (41-14).

Нарбонна 65, Морнингсайд 49
Кристиан Смит набрал 24 очка, а Эйлс Томпсон добавил 20 очков за Нарбонну (1-0).

Palisades 75, Bellflower 71
Д’Андре Белл и Карл Робертсон набрали по 19 очков, а Кори Каунтс добавил 16 очков в игре Palisades (1-0). Колокольчик — 0-1.

Redondo 94, Culver City 45

VICTOR VALLEY CHRISTIAN
Первый раунд

Redlands Calvary Chapel 79, Bermuda Dunes 48
Джозия Ли набрал 27 очков за Calvary Chapel, лидировал (1-0), 18, в перерыве.

WESTERN
Pool play

Western 77, Westminster 40
У Вилмера Фиапая было 29 очков, 14 подборов и 11 передач, Родни Нунгарай — 17 очков, а Маркус Макадамс — 16 очков и 10 подборов за хозяин вестерн (1- 0).Вестминстер — 0: 1.

Garden Grove 41, Glenn 33

NONLEAGUE

Colony 101, New Life Christian 12
Терренс Коллиер набрал 18 очков за принимающую Colony (1-0), в которой шесть игроков показывали двузначные числа. Колони вел, 79-7, в перерыве, а во втором тайме использовались текущие часы. New Life Christian — 0-1.

Community Harvest Charter 54, Shalhevet 51
Сай Прескотт возглавил посещение Community Harvest Charter с 23 очками в первом сезоне для обеих команд.

Diamond Ranch 70, Walnut 62
Тим Миллер набрал 34 очка за Diamond Ranch (1-0). Рики Фишсер набрал 22 очка за хозяина Уолнат (0-1).

Дон Луго 70, Арройо 40
Натан Амброзия набрал 18 очков и пять передач, Кайл Наду набрал 14 очков, а Джамиль Гринвуд закончил с 13 очками, 16 подборами и шестью блокировками в первой победе Дона Луго. У Чейза Кларкли было 14 очков, чтобы опередить Арройо.

Глендейл 40, Бербанк 39
Вааган Тардвердян набрал 11 очков за посещение Глендейла (1-0).Сероб Аганесян возглавил «Бербанк» (0: 1) с 14 очками, 17 подборами и пятью перехватами.

Ирвин 69, Лагуна Бич 63
Грант Веррилл забил пять трехочковых и набрал 31 очко, опередив хозяина Ирвина (1: 0). Чейн Мартин набрал 18 очков за «Лагуна-Бич» (0: 1).

New Roads 63, Windward 42
Мэтт Лэндс набрал 19 очков за New Roads (1-0). Седрик Латимер набрал 17 очков за Наветренного (0: 1).

Redlands Adventist 63, Mesrobian 38
Тим Паскаль набрал 17 очков, четыре перехвата и восемь передач, а Джон Мейси финишировал с 15 очками за Redlands Adventist в первом сезоне для обеих команд.У Джои Василиома было 14 очков, чтобы возглавить Месробяна.

Sage Hill 50, Orangewood Academy 45
У Кевина Джойса было 19 очков и девять подборов, а у Мэтта Лопера 15 очков и пять передач за посещение Sage Hill (1-0). У Криса Кайла было 18 очков за Орангвудскую академию (0-1).

San Gabriel Academy 47, Kilpatrick 41
Шон Палмер набрал 14 очков и 16 подборов в игре San Gabriel Academy (1-0), которая открыла вторую четверть с серии 11-0 и навсегда вырвалась вперед.Лайонел Уайт набрал 15 очков и девять перехватов в пользу Килпатрика (0: 1), что привело к 10: 4 после первой четверти.

Санта-Маргарита 64, Трабуко-Хиллз 46
Джеймс Киф набрал 14 очков и восемь подборов, Кайл Донахью — 14 очков, шесть передач и четыре перехвата, а Тайлер Смит — 12 очков, шесть подборов и пять перехватов, чтобы помочь хозяину Санта-Маргариты. (1: 0), в результате чего к перерыву лидировали 11. Трабуко Хиллз — 0: 1.

Тарбут В ‘Тора 68, Пальмовая долина 25
Джейми Стопницкий набрал 25 очков и 10 передач, чтобы возглавить Тарбут В’ Тора (1: 0).

Verbum Dei 56, Inglewood 48
Мэтт Шоу набрал 16 очков, а Винсент Фуллер добавил 13 очков хозяину Verbum Dei (1-0), который лидировал с 32-21 в перерыве. Инглвуд — 0: 1.

Вилланова Prep 47, Санкт-Бонавентура 37
Меро Марме и Аарон Хартер набрали по 13 очков за хозяина Вилланова (1-0). Джон Зенан набрал 14 очков за «Сент-Бонавентура» (0: 1), который в перерыве уступил ему 21: 19.

Вилла Парк 74, Уиттиер 41
У Криса Яканяна 23 очка и 9 подборов, а у Кайла Джонсона 15 очков и 6 передач, чтобы обогнать «Вилла Парк» (1: 0).Джонотан Валенсуэла имел 11 очков за Уиттиер (0: 1).

Мерфи 65, Риверсайд Нотр-Дам 44
Ганеша 75, Сан-Клементе 71

МЕЖСЕКЦИЯ

Дорси 56, Пасадена 47
Кайл Гибсон набрал 20 очков за хозяина Дорси (1-0).

Mater Dei 109, Карлсбад 69
Марсель Джонс набрал 25 очков, а Крис Генри добавил 23 из 11 из 13 бросков в первой победе сезона в Санта-Маргарите. Первокурсник Тейлор Кинг финишировал с 13 очками, 13 подборами и семью передачами, а разыгрывающий Майк Джеррити имел 19 очков и девять передач.

Черно и Оганесян отказываются возвращаться в «Дом-2» — неэф

Прошлым летом у участников реалити-шоу «Дом-2» Александра Черно и Иосифа Оганесяна родились первенцы. В сентябре, после крещения младенца, пара вернулась к телевизору. Однако в новом качестве и в расширенном составе семья уже не могла вписаться в те рамки, которые они занимали ранее. А Черно сначала пожаловалась на провокации участников и ведущих, а потом собрала вещи и покинула проект.

Несколько недель назад Черно и Оганесян были в подвешенном состоянии — хотели вернуться в проект. Блэк откровенно рассказала подписчикам в микроблоге, что встречалась с продюсерами шоу, обсуждала сроки, а также свои дальнейшие шаги. И сначала она объявила, что вернется. А потом наступила тишина. Поклонники замерли перед телевизорами в ожидании появления любимой пары, но все ушли…

А вечером Черно объявил — не вернутся, и ушел то, что осталось в «Доме-2».

«Тогда это просто стало нашим вниманием. Если честно, вреда в этом не осталось, а легкая грусть », — призналась экс-звезда« Дома-2 ». все самое лучшее еще впереди! «

«Обожаю, дружила. Вышла замуж, родила ребенка. Пора и честь знать », — резюмировал Черно.

«Если честно, мне сложно что-то сказать, потому что это решение было очень сложным. Скажу кратко — И мы счастливы !!! » — нарисовал фото Черный.

Отметим, что Черно пришла на проект весной 2017 года. Она сразу завоевала любовь зрителей, подкупив их своей харизмой, прямотой и открытостью. Позже к ней присоединился хореограф Иосиф Оганесян, завязав отношения, которые часто сопровождались ссорами и сценами ревности.Но в конце 2018 года они поженились. Теперь Черно считает Оганесян идеальным отцом и демонстрирует поклонникам, как он помогает ей с трехмесячным сыном Стефаном.

Доксорубицин инактивирует цитохром с оксидазу миокарда у крыс: кардиозащита с помощью Mito-Q

Abstract

Доксорубицин (DOX) используется для лечения различных видов рака. Однако его клиническое применение ограничено дозозависимой кардиомиопатией. Точный механизм кардиомиопатии, вызванной DOX, до сих пор остается неизвестным.Цели состояли в том, чтобы изучить молекулярный механизм кардиомиопатии, вызванной DOX, и кардиопротекции митохиноном (Mito-Q), трифенилфосфоний-конъюгированным аналогом кофермента Q, на модели крыс. Крыс лечили DOX, Mito-Q и DOX плюс Mito-Q в течение 12 недель. Функция левого желудочка, измеренная с помощью двумерной эхокардиографии, снижалась у крыс, получавших DOX, но сохранялась во время лечения Mito-Q плюс DOX. С помощью низкотемпературного электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) ex vivo было обнаружено зависящее от времени уменьшение гемового сигнала в тканях сердца, выделенных от крыс, которым вводили кумулятивную дозу DOX.DOX ослаблял сигналы ЭПР, характерные для обменного взаимодействия между цитохромом c оксидазой (C c O) -Fe (III) гемом a ₃ и Cu _B . DOX и Mito-Q вместе восстанавливали эти сигналы ЭПР и активность C c O в тканях сердца. DOX сильно подавлял стабильную экспрессию субъединиц II и Va C c O и оказывал небольшое ингибирующее действие на экспрессию гена субъединицы I C c O. Mito-Q восстанавливал экспрессию субъединицы II C c O и Va у крыс, получавших DOX.Эти результаты предполагают новый механизм кардиозащиты с помощью Mito-Q при кардиомиопатии, вызванной DOX, с участием C c O.

Введение

Доксорубицин (DOX), антрациклиновый хиноновый антибиотик, широко используется при лечении нескольких видов рака, включая рак груди. рак, болезнь Ходжкина и лейкемия (1,2). Однако его клиническое применение ограничено дозозависимой острой и хронической кардиотоксичностью, которая является кумулятивной и необратимой (3–5). Сердечные дисфункции, т.е.е. необратимая застойная сердечная недостаточность, аритмии и кардиомиопатия являются основной причиной смертности онкологических больных, получавших DOX (6,7). Проблемы с сердцем у онкологических больных, принимающих DOX, не проявляются в течение нескольких лет после прекращения химиотерапии (8,9). У детей, лечившихся от лейкемии с помощью DOX, через много лет после химиотерапии DOX развиваются сердечные заболевания (например, нарушение сократимости левого желудочка и поздняя застойная сердечная недостаточность) (10,11). Оценки показывают, что дети, которые проходят химиотерапию DOX, почти в восемь раз более подвержены развитию проблем с сердцем в более позднем возрасте (11).Точный механизм запоздалой кардиотоксичности, вызванной DOX, все еще остается неизвестным, хотя было предложено несколько механизмов, включая окислительный стресс, повреждение митохондриальной ДНК, внутриклеточную перегрузку кальцием, выброс цитокинов и нарушение адренергической функции миокарда (12,13).

Недавние исследования показывают, что лечение DOX вызывает апоптоз в миоцитах и ​​эндотелиальных клетках (14–16). Апоптоз миокарда в конечном итоге приводит к кардиомиопатии из-за систематического уменьшения количества кардиомиоцитов (17).DOX также вызывает острую токсичность, включая эндотелиальную дисфункцию (18). Органом-мишенью токсичности DOX является миокард, обогащенный митохондриями. Предыдущие сообщения предполагают, что одна из причин, почему сердечная мышца более восприимчива к повреждению, вызванному окислителями, связана с наличием низких уровней антиоксидантных ферментов, таких как каталаза, в миоцитах (19, 20). DOX со временем накапливается в митохондриях. Сообщалось, что внутримитохондриальная концентрация DOX почти на два порядка выше, чем его внеклеточная концентрация в культуральной среде (21,22).Таким образом, при клинически значимых концентрациях в плазме (0,5-1 мкМ, М) внутримитохондриальная концентрация DOX должна составлять ~ 50-100 мкМ М. Селективная токсичность DOX для сердца объясняется избирательным повреждением сердечных митохондрий. (20).

Ранее было показано, что введение кофермента Q (Co-Q) предотвращает возникновение и прогрессирование кардиомиопатии, вызванной DOX (23). Введение Co-Q привело к улучшению изменений ЭКГ и повышению выживаемости (23). Было высказано предположение, что липофильный метаболит агликона DOX предположительно проникает через внутреннюю мембрану, вытесняя Co-Q, что приводит к резкому повышению уровня Co-Q в плазме у пациентов во время химиотерапии DOX.Хотя для борьбы с токсичностью DOX ранее были разработаны многочисленные антиоксидантные методы лечения (24), большинство из этих средств не были особенно эффективными. Кроме того, эти антиоксиданты не были специально нацелены на митохондрии клеток. Недавние разработки в области органического синтеза сделали возможным специфическое воздействие на митохондрии (25–27). Антиоксиданты, такие как витамин-E и кофермент-Q, были связаны с катионом трифенилфосфония, и полученные соединения (Mito-E и Mito-Q) преимущественно поглощались митохондриями (26,27).Движущей силой, ответственной за накопление в митохондриях липофильных катионов трифенилфосфония, является большой мембранный потенциал 150-180 мВ (отрицательный внутри) через внутреннюю мембрану митохондрий (26,27). Было показано, что Mito-Q накапливается в митохондриях от 50 до 100 раз (27).

Для более точной имитации кардиомиопатии, вызванной DOX в клинике, крысам Sprague-Dawley хронически вводили более низкие дозы один раз в неделю (2,5 мг / кг) и выполняли 2D-эхокардиографию для оценки морфологических и функциональных изменений в организме. левый желудочек.Эта модель согласуется с ранее установленной моделью хронической кардиомиопатии, вызванной DOX (28). Сердечные ткани изобилуют электронным парамагнитным резонансом (ЭПР), активными биядерными и моноядерными центрами Cu, Fe и различными двух-, трех- и четырехъядерными кластерами Fe-S (29) (). В этом исследовании мы изучили уровни митохондриальных субъединиц цитохрома c оксидазы и кластеров серы, железа, переносящего электрон, с использованием установленной модели на крысах, которая имитирует более низкие дозы DOX, используемые для изучения кардиомиопатии, вызванной DOX, в клинике.Лечение с использованием DOX или DOX плюс Mito-Q, аналог коэнзима-Q, сравнивали для оценки кардиозащитных эффектов Mito-Q. Электронное состояние компонентов цитохрома c оксидазы контролировали с помощью низкотемпературного (жидкий гелий) ЭПР в Х-диапазоне ex vivo.

Железно-серные центры митохондриальной дыхательной цепи, цитохромы и активные металлические центры, участвующие в процессе переноса электронов. ( I ) НАДН-дегидрогеназа, ( II ) сукцинатдегидрогеназа, ( III ) цитохром c редуктаза и ( IV ) цитохром c оксидаза.

Наши данные показали, что обработка DOX изменяет обменное взаимодействие между высокоспиновым гемом a ₃ и Cu _B в комплексе IV, но не затрагивает кластеры серы железа. После продолжительного лечения DOX уровни субъединиц II и Va были снижены по сравнению с другими субъединицами цитохрома c оксидазы (C c O). Mito-Q ослаблял эффекты лечения DOX.

Материалы и методы

Материалы

Гидрохлорид DOX, ротенон, диэтилентриаминпентауксусная кислота, цитохром c , антимицин, ЭДТА, трис, убихинон-1, цианид калия и НАДН были приобретены у Sigma Chemical (St.Луис, Миссури). Митохинон (Mito-Q ₁₀ ) был синтезирован по опубликованной методике с некоторыми модификациями (30). Основное различие между нашей процедурой и опубликованной процедурой (30) заключается в синтезе промежуточного бромидебенона из идебенона (рис. S1 в вспомогательном материале). Опубликованный способ получения бромидебенона включал использование тетрабромида углерода и трифенилфосфина. Bovine C c O был получен в подарок от доктора Хельмута Бейнерта (Департамент биохимии, Университет Висконсина, Мэдисон).

Протоколы ухода за животными и их лечения

Все процедуры с животными были одобрены Комитетом по уходу и использованию институциональных животных Медицинского колледжа Висконсина, а исследование соответствует Руководству по уходу и использованию лабораторных животных , опубликованному Национальным агентством США Институты здравоохранения (Публикация NIH № 85–23, пересмотрена в 1996 г.). Использовали самцов крыс Sprague-Dawley массой 250-260 г, потому что самки могут обладать сердечными защитными эффектами из-за эстрогена наряду с повышенным уровнем активности теломеразы, что может увеличить способность к регенерации тканей.Животные были размещены в помещении для содержания животных и имели свободный доступ к диете, состоящей из обычного крысиного корма (Харлан Теклад, Мэдисон, Висконсин) и воды ad libitum.

Животных случайным образом распределили на четыре разные группы лечения: контроль ( n = 16), DOX ( n = 11), DOX плюс Mito-Q ( n = 12) и Mito-Q ( n). = 19) (рис. S2). В эксперименте I крысам внутривенно вводили 2,5 мг / кг в неделю гидрохлорида доксорубицина, растворенного в физиологическом растворе, а контрольные группы получали такой же объем физиологического раствора (0.9% раствор натрия хлорида). В эксперименте II вводили DOX (2,5 мг / кг в неделю) и Mito-Q (5,0 мг / кг путем внутрибрюшинной инъекции дважды в неделю). В эксперименте III один Mito-Q (5,0 мг / кг) вводили в аналогичных условиях. В течение этого периода массу тела крысы и эхокардиограммы получали на исходном уровне, через 4, 8, 10 и 12 недель после начала лечения. Через 4, 8, 10 и 12 недель лечения животных умерщвляли внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (90 мг / 100 г массы тела).Сердце немедленно вырезали и хранили в жидком азоте для гистологии и измерений ЭПР. Ткани для гистологии фиксировали в цинко-формальдегидном растворе (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания).

Измерения ЭПР

ЭПР тканей сердца в Х-диапазоне регистрировали при температурах жидкого гелия на спектрометре Bruker E500 ELEXYS с модуляцией поля 100 кГц, оснащенном гелиевым криостатом Oxford Instrument ESR-9 и полостью DM-0101. Для измерений ЭПР ткани сердца вырезали и погружали в жидкий азот, измельчали ​​до подходящего размера в жидком азоте и затем переносили в кварцевую трубку ЭПР диаметром 4 мм (Wilmad-Lab Glass, Буэна, Нью-Джерси).Вес ткани сердца в каждом эксперименте ЭПР составлял ~ 0,3 г. Фактор упаковки ткани не воспринимался как серьезная проблема, поскольку повторная загрузка тканей в одну и ту же трубку ЭПР (с другой упаковкой) приводила к спектрам ЭПР с изменением интенсивности сигнала на 5%. Бычье сердце C c O (30 μ M), присутствующее в 10% додецилмальтозиде, содержащем 100 мМ кали / HEPES, pH 7,0, использовали в качестве стандарта. Условия спектрометра были следующими: частота микроволн 9,635 ГГц; частота модуляции 100 кГц; амплитуда модуляции 10 Гс; усиление приемника 85 дБ; постоянная времени, 0.01 с; время преобразования 0,08 с; время развертки 83,9 с. Спектры ЭПР были получены в интервале температур 4 — 50 К при мощности падающего микроволнового излучения 5 мВт и амплитуде модуляции 10 Гс. сигнал с центром в g = 2,0036.

Моделирование ЭПР

Спектры ЭПР для обменно-связанной двухспиновой системы были успешно подобраны с использованием спинового гамильтониана, показанного в формуле.1 в разделе «Результаты». Все компьютерные симуляции спектров ЭПР были рассчитаны на основе диагонализации этого уравнения с помощью программы XSophe. Для получения собственных значений и собственных векторов использовался метод диагонализации матрицы. Для биядерного центра Fe (III) (гем a ₃ ) Cu _B (II) с антиферромагнитной связью, где S ₁ = 5/2 и S ₂ = 1 / 2, энергетическая матрица 12 × 12 была получена, когда были включены все двенадцать спиновых переходов (т.е.е., (2 S ₁ + 1) × (2 S ₂ + 1) = 12). Показаны спектры ЭПР при насыщении СВЧ-мощности и при переменной температуре (рис. S4 и S5).

Активность НАДН-хинонредуктазы (комплекс I), CcO и аконитазы

Активность комплекса I определяли при 30 ° C как уменьшение поглощения при 340 нм с 200 мкМ M NADH и 100 мкМ M убихинон-1 в присутствии 1,5 мМ KCN. Активность C c O измеряли спектрофотометрически по окислению ферроцитохрома c при 550 нм (31).Стандартная смесь для анализа содержала следующее: 0,25 М сахарозы, 50 мМ Трис / Cl — (pH 8,0), 0,2 мМ ЭДТА калия и ферментный препарат (митохондрии ∼10 мкМ г белка / мл). Активность аконитазы определяли спектрофотометрически, отслеживая исчезновение цис- -аконитата, как сообщалось (32).

Измерения активности каспазы

Вырезанное сердце промывали ледяным буферным раствором Кребса-Хенселейта, содержащим 118 мМ NaCl, 4,75 мМ KCl, KH ₂ PO ₄ 1.19 мМ, MgSO ₄ 1,19 мМ, CaCl ₂ 2,54 мМ, NaHCO ₃ 25 мМ, ЭДТА 0,5 мМ и глюкоза 11 мМ и немедленно замораживаются в жидком азоте. Затем замороженную ткань измельчали ​​в порошок, используя ступку и пестик, и ресуспендировали в ледяном буфере для лизиса (50 мМ HEPES, pH 7,4, 0,1% CHAPS, 5 мМ DTT, 2 мМ EDTA, 2 мМ EGTA, Triton X- 100, 0,1%), содержащий 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и 10 мкл г / мл апротинина и лейпептина. Гомогенаты центрифугировали при 14000 × g в течение 10 мин и использовали супернатанты.Белки (100 мкМ г) разбавляли буфером для анализа (50 мМ HEPES, pH 7,4, 100 мМ NaCl, 0,1% CHAPS, 10 мМ DTT, 2 мМ EDTA, 2 мМ EGTA, Triton X-100, 0,1%, и инкубировали при 25 ° C с DEVD- p NA (ацетил Asp-Glu-Val-Asp пара нитроанилид), ac-LEHD p NA (ацетил Leu-Glu-His-Asp p NA), и ac-IETD p NA (acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp- p NA) в качестве субстратов (каждая конечная концентрация 200 мкМ M). спектрофотометра и количественно оценили с помощью подходящего стандарта (33).

Иммуноблот-анализ содержания субъединиц цитохрома

Белки подвергали электрофорезу на 15% полиакриламидных гелях, как описано Kotamraju (33). Условия вестерн-блоттинга и иммунодетекции белков были такими же, как описано ранее (34). Специфические взаимодействия антител тестировали путем зондирования с помощью моноклональных антител к C c O субъединицам I, II, IV и Vb, полученным от Mitosciences (Юджин, Орегон). Вторичные антитела выявляли и количественно определяли путем инкубации мембраны с West Femto Super Signal (Pierce, IL).Блоты количественно оценивали с помощью сканера изображений STORM (Molecular Dynamics, Саннивейл, Калифорния).

Эхокардиография

Трансторакальная двумерная эхокардиография (Vivid 7 Echocardiograph, General Electric, Waukesha, WI) выполнялась с использованием линейного датчика 11 МГц на исходном уровне, через 4, 8, 10 и 12 недель на всех анестезированных животных. с использованием 0,25 мг / кг медтомидина и 75 мг / кг кетамина. Грудь животного для процедуры была выбрита. Использовалась парастернальная короткая ось на уровне середины левого желудочка, что подтверждалось наличием выступающих папиллярных мышц.Была выполнена 2-мерная эхокардиография в B-режиме. Автономный анализ выполняли с использованием рабочей станции Echopac (General Electric, Waukesha, WI). Радиальная деформация миокарда, внутренняя мера механики миокарда, была получена с использованием программного обеспечения Q-анализа (General Electric, Waukesha, WI), как сообщалось ранее (31). Вкратце, эндокардиальная граница была прослежена, а эпикардиальная граница была очерчена вручную. Программное обеспечение автоматически вычисляет радиальную деформацию (процентное изменение длины сегмента миокарда в направлении или от центра сердца в виде короткой оси) из шести равноудаленных сегментов левого желудочка.Глобальная радиальная деформация представляла собой среднее значение шести сегментарных радиальных деформаций. Для анализа использовали данные крыс, выживших> 8 недель.

Статистический анализ

Для радиальной деформации использовали повторный анализ вариации с обработкой и временем в качестве ковариантов (Sigmastat 3.5, Systat Software Richmond, VA). Для попарного анализа использовали метод Холма-Сидака. Значимое значение p было установлено на уровне p = 0,05.

Результаты

Введение Mito-Q предотвращает индуцированную DOX сердечную дисфункцию

Первоначально сердечную функцию после лечения DOX, с одновременным введением Mito-Q и без него, контролировали по физиологическим параметрам и с помощью 2D-эхокардиографии.Как показано на рис. S2, животные были разделены на четыре группы. После 10 недель лечения DOX животные стали слабыми и вялыми, а цвет кожи стал бледным по сравнению с контрольными крысами. Наиболее заметной особенностью у животных, получавших DOX, было развитие увеличенного живота и асцита после восьми недель лечения DOX; После умерщвления было отмечено значительное количество перитонеальной жидкости. Кроме того, масса тела крыс, получавших DOX, была значительно ниже, чем у контрольных ().После 10 недель лечения вес сердца крыс, получавших DOX, был значительно меньше, чем у контрольных. Напротив, масса тела и масса сердца крыс, получавших DOX плюс Mito-Q, были аналогичны таковым у контрольных крыс и крыс, получавших Mito-Q. Продолжительное лечение Mito-Q частично обратило вспять неблагоприятные побочные эффекты, вызванные введением DOX ().

( A ) Изменения массы сердца крыс после 12 недель лечения DOX, Mito-Q и DOX плюс Mito-Q. ( B ) Изменения массы тела крыс, подвергшихся лечению DOX, как показано на рис.S2.

Лечение DOX ухудшило функцию миокарда. Деформация миокарда является показателем внутренней механики миокарда (31). Двумерная деформационная эхокардиография служит чувствительным методом измерения дисфункции миокарда как на моделях людей, так и на грызунах, и превосходит другие традиционные измерения функции желудочков. Введение DOX вызвало снижение сердечной функции, оцененное с помощью эхокардиографии (31). Наблюдалось постепенное снижение общей радиальной деформации, начиная с восьми недель после лечения DOX ().Совместное введение Mito-Q предотвращало прогрессирующее снижение глобальной радиальной деформации, наблюдаемое при лечении только DOX.

( A ) Эндсистолические 2D изображения в B-режиме на уровне среднего желудочка: ( 1 ) Контрольная крыса, ( 2 ) лечение DOX в течение 12 недель, ( 3 ) лечение DOX плюс Mito-Q для 12 недель и ( 4 ) лечение Mito-Q в течение 12 недель. ( B ) Анатомический M-режим через переднюю и внутреннюю стенки. ( C ) График, показывающий радиальную деформацию в одном сердечном цикле 6 эквидистантных областей миокарда в виде короткой оси.Глобальная радиальная деформация рассчитывалась как среднее значение всех шести сегментов.

Ex vivo низкотемпературные спектры ЭПР контрольных тканей сердца: эффекты DOX и DOX плюс Mito-Q

Для оценки статуса окислительно-восстановительных компонентов сердечной ткани крыс умерщвляли после определенных протоколов лечения. Как показано на фиг. S2, крыс умерщвляли через 4, 8, 10 и 12 недель лечения, а сердца удаляли и замораживали для анализа ЭПР. Спектры ЭПР тканей сердца контрольных крыс регистрировали при 15 К ( А ).Наиболее четко различимые сигналы связаны с высокоспиновым гемом при г = 6,0, отнесенным к гему a ₃ (Fe _{a 3} ³⁺ Cu _B ¹⁺ состояние C c O), высокоспиновый цитохром c и сигнал трехъядерного кластера 3Fe-4S при g = 2,015 (35). При более высоком усилении были заметны другие поглощения ЭПР ( A, пунктирная линия ). На основе спектрального моделирования составной спектр ЭПР был разложен на несколько различных видов (рис.S3). Поскольку сердечные ткани обогащены митохондриями, также были обнаружены сигналы, исходящие от биядерного [2Fe-2S] кластера (N1), комплекса II или III и трех четырехъядерных [4Fe-4S] кластеров (N2, N3 и N4). Параметры ЭПР, полученные в результате компьютерного моделирования, согласуются с ранее сообщенными для комплексных I, II и III кластеров железо-сера (35). Спектр ( A ) также состоит из сигнала низкоспинового гема при g _z = 3,0 [гем a , цитохром c ] и при g _z = 3.9-3.2 (cyt- b _H и cyt- b _L ) соответственно (36,37). Моделирование этих сигналов было достигнуто с использованием параметра большой ширины линии, что позволяет предположить, что эти поглощения являются либо магнитно-связанной системой, либо что имеется уширение при деформации. Резонанс при g _z = 2.16 был отнесен к биядерному центру Cu _A Cu _A комплекса IV (38). Сигнал Cu _A Cu _A при g = 2.02 был закрыт сильным сигналом 3Fe-4S. Кроме того, сигнал ЭПР, обнаруженный при g = 4,3, предположительно был отнесен к ромбическому железу (III). Экспериментальный и смоделированный спектры ЭПР аутентичного фермента C c O показаны на рис. S6.

( A ) ( Top ) Спектры ЭПР в X-диапазоне контрольных тканей сердца крыс. ЭПР проводили при 15 К с использованием СВЧ мощности 5 мВт. ( Нижний ) То же, что и выше, но с большим усилением. ( B ) Спектры ЭПР с динамикой времени, полученные для сердечных тканей, выделенных от крыс, получавших DOX на 0, 4, 8, 10 и 12 неделях.Спектры ЭПР регистрировали при 10 К с использованием СВЧ мощности 5 мВт. ( C ) Интенсивность сигнала ЭПР г = сигнал 6.0. Значения даны как среднее ± стандартная ошибка. ^∗ p <0,05 по сравнению с контролем. Статистический анализ проводили с использованием непарного критерия Стьюдента t .

B показывает влияние DOX на спектры ЭПР тканей сердца с течением времени. Ткани сердца были изолированы от крыс после 4, 8, 10 и 12 недель лечения DOX. Первоначально интенсивность EPR сигнала g = 6 (назначенного гему a ₃ C c O) после четырех недель лечения DOX увеличивалась.После этого интенсивность этого сигнала ( г, = 6) уменьшалась с увеличением продолжительности лечения DOX. Однако на сигналы ЭПР ( г, = 2,013), соответствующие Fe-S-кластерам комплекса I, II и III, обработка DOX в тех же условиях существенно не влияла. В присутствии DOX и Mito-Q интенсивности сигналов ЭПР при г = 6, полученные от тканей сердца после 4, 8, 10 и 12 недель лечения DOX, были аналогичны тем, которые были получены от контрольных тканей.Эти результаты предполагают, что длительное лечение DOX разрушает C c O в тканях миокарда и что защитный эффект Mito-Q у крыс, получавших DOX, может быть связан с восстановлением интенсивности сигнала гема a ₃ C c O в тканях сердца ( C ).

Влияние DOX и Mito-Q на обменно-связанные резонансы

Heme a _{3 Сайты} и Cu _B находятся в непосредственной близости и, таким образом, демонстрируют обменную связь.показаны спектры ЭПР контрольных тканей сердца, полученные при более высокой мощности микроволн. При низких температурах (= 10 K) и при более высокой мощности микроволн (120 мВт) сигналы ЭПР при g _z = 3,0, возникающие из-за низкоспинового Fe (III) гема a и цитохрома c . были частично насыщены для анализа обменно-связанных резонансов. Обменные связанные спектры были лучше всего смоделированы ( B ) на основе слабого магнитного обменного взаимодействия между высокоспиновым гемом Fe (III) и Cu (II) C c O, описываемого эффективным спин-гамильтонианом, включающим обменную связь. тензор Дж (Ур.Cu

(1)

, где первый член представляет локальный спин-гамильтониан для иона Fe (III) гема S = ⁵ / ₂ и содержит зеемановский, аксиальный ( D ) и ромбический ( E ) члены расщепления в нулевом поле соответственно. Второй член — это спин-гамильтониан Зеемана для S = ¹ / ₂ Cu _B (II). Когда обменное взаимодействие слабое, | J | «| D | аксиальное расщепление в нулевом поле на геме расщепляет уровни Fe (III) на три дублета Крамерса, M _s ^Fe = ± 5/2, ± 3/2 и ± 1/2, разделенных на энергии на 2 D и 4 D соответственно.Самый низкий дублет, M _s ^Fe = ± ¹ / ₂ , имеет типичные значения D 5-7 см ⁻¹ . Обменная связь между каждой из этих трех пар Крамерса и одной парой Крамерса Cu _B (II) S = ¹ / ₂ дает три набора состояний, каждый из которых состоит из четырех уровней с компонентами самый низкий набор, характеризуемый значениями M _S 0, 0, +1 и -1.Превосходное моделирование, основанное на модели слабой обменной связи, как показано на (, вставка ), было получено с использованием заявленных значений расщепления в нулевом поле, D = 5 см ⁻¹ и E = 0,03 см ⁻¹ , | J | составляет ∼1 см ⁻¹ и d = 5,0 Å (расстояние между Fe a ₃ и Cu _B ) (39).

( A ) Обменно-связанные спектры ЭПР, измеренные с использованием высокой мощности микроволн, 100 мВт при 10 К ( сплошная линия ) экспериментально; ( пунктирная линия ) смоделированная сумма B , C, и D в различных пропорциях).( B ) Моделирование обменного взаимодействия между Fe (III) a ₃ Cu (II) _B в C c O с использованием высокоспиновых параметров Fe (III), г _x = 5.9 , г _y = 5,9, г _z = 2,0, D = 5 см ⁻¹ , E / D = 0,03 и Cu (II) г _x = 2.06, г _y = 2.06, г _z = 2.23, J = 1 см ⁻¹ и расстояние 5 Å между центрами Fe (III) и Cu (II).( C ) Моделирование низкоспинового гема Fe (III) с использованием г значений гема a C c O и цитохрома c . (вставка) Диаграмма уровней энергии для обменно-связанного Fe (III) -Cu (II) _B , показывающая переходы, приводящие к g = 2,95 и 12 резонансов в спектрах ЭПР, измеренных при большой мощности

| A〉 = 12 (| 12, −12〉 — | −12,12〉) Ms = 0

| B〉 = — sinϕ | 32, −12〉 + cosϕ | 12,12〉 Ms = + 1

| C〉 = −sinϕ | −32,12〉 + cosϕ | −12, −12〉 Ms = −1

| D〉 = 12 (| 12, −12〉 — | −12,12〉) Ms = 0

где tan 2 ϕ = (8) ^1/2 J / (2 D — J ).( D ) Моделирование низкоспинового гема Fe (III) с использованием г значений, опубликованных для цитохрома b _H и цитохрома b _L цитохрома c редуктазы.

A (сигнал, отмеченный ↓) показывает ингибирующие эффекты лечения DOX в течение 12 недель на обменно-связанные переходы, наблюдаемые при более высоких мощностях в тканях сердца. После лечения Mito-Q в течение 12 недель в тканях сердца частично восстанавливались широкие сигналы, обусловленные гемом a ₃ / Cu _B или C c O.Однако DOX и DOX плюс Mito-Q не влияли на сигналы ЭПР, наблюдаемые при g = 2,015, которые характерны для окислительно-инактивированных центров серы железа ( B ).

( A ) Спектры обменно-связанных ЭПР тканей сердца, полученные от контрольных крыс, крыс, получавших DOX, в течение 12 недель и крыс, получавших DOX плюс Mito-Q, в течение 12 недель. Спектры получали при 10 К с использованием микроволновой мощности 100 мВт ( сплошная линия ) экспериментально; ( пунктирная линия ) смоделировано.( B ) Влияние DOX / Mito-Q на спектры ЭПР железо-серного кластера, записанные при 10 К с использованием микроволновой мощности 5 мВт.

Влияние DOX и Mito-Q на экспрессию субъединиц CcO

Иммуноблот-анализ четырех субъединиц C c O был проведен в тканях сердца, полученных из контрольных, обработанных DOX, обработанных Mito-Q и DOX плюс Mito- Крысы, обработанные Q. показывает уровни субъединиц I, II, IV и Va, обнаруженные в общих гомогенатах сердца. Обратите внимание, что со временем наблюдается почти постоянная экспрессия C c O IV.Однако экспрессия субъединиц II и Va была более серьезно затронута с почти 65-70% снижением их уровней после лечения DOX в течение 12 недель по сравнению с контролем. Введение Mito-Q крысам, получавшим DOX, значительно улучшило экспрессию субъединиц C c O. Однако лечение DOX в течение четырех или восьми недель не показало каких-либо значительных изменений C c O на уровнях субъединиц в тканях сердца ().

Иммуноблот-анализ субъединиц C c O (I-Va), выделенных из сердец крыс после 4, 8 и 12 недель приема DOX и DOX плюс Mito-Q.Протоколы экспериментов показаны на рис. S2.

Mito-Q ингибирует DOX-опосредованный фиброз и апоптоз

Ткани сердца, окрашенные трихромовым синим, не показали явных гистологических различий между контрольными животными и животными, получавшими только Mito-Q (фиг. S8). Однако у животных, получавших DOX, наблюдался значительный фиброз. Срезы сердца животных, получавших Mito-Q плюс DOX, показали значительно меньший фиброз по сравнению с группой DOX (рис. S8). Активность каспазы-3 была значительно выше в группе DOX по сравнению с контролем после лечения DOX в течение восьми недель (рис.S9). Активность каспазы-3 была снижена в группе DOX плюс Mito-Q по сравнению с группой DOX. Активность комплекса IV определяли в митохондриях сердца, выделенных от контрольных крыс, получавших DOX, и крыс, получавших DOX плюс Mito-Q. Обработка DOX вызвала снижение активности комплекса IV примерно на 60% (рис. S9). Не наблюдалось значительного снижения активности комплекса IV у крыс, получавших только Mito-Q, и Mito-Q значительно восстанавливал активность комплекса IV у крыс, получавших DOX ( p <0.05). Из этих результатов мы можем заключить, что Mito-Q специфически влияет на путь, с помощью которого DOX вызывает снижение активности комплекса IV.

Обсуждение

Митохондриальная дисфункция была связана с кардиотоксичностью DOX. Точные механизмы ингибирования DOX митохондриального транспорта электронов и окислительного фосфорилирования не совсем понятны. Богатая митохондриями сердечная ткань состоит из множества комплексов I-IV с несколькими белками-центрами металлов, а именно кластерами Fe-S, гемом и биядерными Cu (II) и Fe (III) -Cu (II) в их активных центрах.Здесь мы использовали низкотемпературный ЭПР X-диапазона ex vivo для мониторинга изменений митохондриальных белков, индуцированных DOX во время кардиомиопатии и кардиопротекции с помощью Mito-Q.

Спектры ЭПР тканей сердца, полученные при температурах жидкого гелия, повторяют данные об обменном взаимодействии, о которых ранее сообщалось в изолированных препаратах C c O. Результаты ЭПР этого исследования показывают, что хроническое лечение DOX снижает высокоспиновый гем a ₃ и разъединяет обменно-связанный гем a ₃ с Cu _B в ферменте C c O у крыс. сердца.Одновременно снижалась активность C c O и экспрессия каталитических субъединиц (C c O II и C c O Va). Mito-Q восстановил интенсивность сигнала гема a ₃ и сигнал связанного гема a ₃ и Cu _B из C c O в тканях сердца, а также функцию сердца и C c Активность O у крыс, получавших DOX. Эти результаты предполагают новый механизм, включающий ингибирование C c O и сердечную дисфункцию во время лечения DOX.

Влияние DOX и Mito-Q на спектры ЭПР сердечной ткани

Моделирование спектров ЭПР сердечной ткани крыс выявило присутствие 4Fe-4S, 3Fe-4S, гема (высокоспиновый и низкоспиновый), биядерной меди Cu (II) и центры Fe (III) Cu (II) в митохондриальной цепи переноса электронов. Сравнение спектров ЭПР C c O из ткани сердца с очищенным C c O (рис. S6) показывает, что сигналы g = 6, 3 и 2,16 относятся к гему a ₃ (высокий спин), гем a (низкий спин) и двухъядерный Cu _A из C c O.После обработки DOX сигнал g = 6 первоначально увеличивается из-за частичного восстановления биядерного сайта, Fe (III) Cu (II) C c O до Fe (III) Cu (I) плюс окисленный высокоспиновый сигнал от цитохрома c (40). Через четыре недели сигнал g = 6 постепенно уменьшался. Однако характерные сигналы, обусловленные кластерами Fe-S, а именно 3Fe-4S, 4Fe-4S, 2Fe-2S, гем комплексов II и III и неспецифический сигнал железа при г = 4,3 в группе, обработанной DOX, были было обнаружено, что они похожи на контрольные сердечные ткани.Таким образом, активные металлические центры комплексов I – III, обнаруженные с помощью ЭПР, не были затронуты обработкой DOX в этой хронической модели. Обработка Mito-Q восстановила интенсивность сигнала g = 6,0. Сигнал, присвоенный цитохрому c ₁ ( g _z = 3,9), цитохрому b _H ( g _z = 3,4) и цитохрому b _L 9000 На _z = 3,75) комплекса-III не влияли DOX или обработка DOX плюс Mito-Q.Эти результаты показывают, что гемы комплекса III и кластеры железо-сера, обнаруженные с помощью ЭПР, не подвергались воздействию DOX в этой хронической модели кардиомиопатии на крысах.

Влияние DOX и Mito-Q на обменно-связанные резонансы между Fea

Предыдущие результаты ЭПР показывают, что C c O с биядерным активным центром, Fe a ₃ Cu _B показывают обменно-связанные резонансы при g, = 2,95 и 12 при более высокой мощности микроволн (40).Зависимость мощности микроволн от сигналов ЭПР от контрольных, обработанных DOX и Mito-Q сердечных тканей была аналогичной. С увеличением мощности микроволн пиковая интенсивность при g = 2,95 и 12 становилась более выраженной. Широкие резонансы, наблюдаемые в сердечных тканях, были аналогичны предыдущим отчетам, в которых C c O был восстановлен дитионитом натрия в течение 2 с (40,41). Компьютерное моделирование спектров ЭПР с обменной связью с использованием заявленных параметров C c O на основе модели слабой обменной связи (41,42) дало достаточно хорошее соответствие.После обработки DOX интенсивности сигналов при g = 2,95 и 12 уменьшились, как и у сигнала g = 6. Через 10-12 недель после лечения DOX эти сигналы значительно уменьшились. Однако в присутствии Mito-Q эти сигналы частично восстанавливались. Результаты ЭПР согласуются с наблюдаемым снижением активности фермента C c O после продолжительной обработки DOX и последующим восстановлением активности C c O во время обработки Mito-Q.

DOX-индуцированное подавление экспрессии субъединиц CcO

Комплекс IV дыхательной цепи митохондрий состоит из 13 полипептидных цепей (43). Три более крупные каталитические субъединицы (C c OI, C c O II и C c O III) кодируются митохондриальной ДНК, а оставшиеся более мелкие субъединицы (IV-VIII) кодируются ядерной ДНК. (43) (Рис S10). Мутации в митохондриальных и ядерных генах, кодирующих полипептиды дыхательной цепи, часто приводят к кардиомиопатии (44).Сообщалось, что лечение DOX ингибирует активность C c O в сердечных тканях и лейкозных клетках (45). DOX снижает экспрессию митохондриально-кодируемых субъединиц C c O, C c O I и C c O II (46–48). В другом сообщении было показано, что сверхэкспрессия белка металлотионеина снижает кардиотоксичность, вызванную DOX (49). Кардиопротекция сопровождалась активацией субъединицы C c O Va (49). Данные in vivo показывают, что субъединицы C c O II и C c O Va значительно уменьшились в тканях сердца после 12 недель лечения DOX ().Было 25% снижение экспрессии C c O I. Введение Mito-Q полностью восстановило экспрессию C c OI, C c O II и C c O Va. Ранее сообщалось, что введение дексразоксана восстанавливает митохондриальную ДНК-кодируемую C c O субъединицу II в Крысы, получавшие DOX (50). Как упоминалось ранее, обе субъединицы I и II C c O кодируются митохондриями, тогда как C c O Va кодируется ядерной ДНК. Это предполагает, что кардиотоксичность, вызванная DOX, может включать изменения как в митохондриальном, так и в ядерном геномах, и что Mito-Q ингибирует окислительное повреждение митохондриальной и ядерной ДНК.

В качестве альтернативы сообщалось о связывании антрациклинов (дауномицин и доксорубицин) с C c O в раковых клетках (51). В этом исследовании исследователи предполагают, что C c O является потенциальным сайтом-мишенью для антрациклинов и что это взаимодействие с C c O является вероятным механизмом токсичности DOX (52). C c O также является мишенью для противоопухолевого ретиноидного препарата, N — (4-гидроксифенил) ретинамида (53). Было показано, что этот химиотерапевтический препарат снижает активность C c O за счет подавления субъединицы III C c O (53).Данные, представленные здесь (рис. S4), показывают, что на насыщение мощности низкоспинового гема а влияет добавление DOX, что позволяет предположить, что среда, окружающая гем а , была изменена. Наши результаты EPR также показывают, что интенсивность сигнала гема a ₃ , связанного с Cu _B в тканях сердца, была изменена во время обработки DOX и восстановлена ​​Mito-Q ().

C c O катализирует перенос электронов от цитохрома c к кислороду, образуя воду и создавая необходимую электрохимическую разность потенциалов для синтеза АТФ посредством протонной перекачки.Субъединица 1 C c O содержит гем a , гем a ₃ и Cu _B . Гем a ₃ и Cu _B образуют биядерный центр, место, где молекулярный кислород восстанавливается до воды. Сайт Cu _A в субъединице II C c O содержит два атома меди. Цитохром c связывается с отрицательно заряженной областью субъединицы II и переносит электроны на Cu _A , расположенный в субъединице II (54).Электроны из Cu _A впоследствии переносятся на гем a и, в конечном итоге, на биядерный центр (рис. S10). Связывается ли DOX с отрицательно заряженной областью C c O субъединицы II (сайт связывания богатого лизином, положительно заряженного домена цитохрома c ) и изменяет ли распределение электронов от цитохрома c в C c О-субъединица II остается неизвестной. Mito-Q может конкурировать за один и тот же сайт связывания, тем самым ингибируя взаимодействие C c O / DOX и поддерживая перенос электронов в C c O.Этот гипотетический сценарий аналогичен бактериальным хинолоксидазам, где убихинон / убихинол опосредует перенос электрона от сайта окисления хинола к низкоспиновому гему B (55). Оптические данные и данные ЭПР, полученные в модельной системе, состоящей из DOX, гемина и Mito-Q / гемина (рис. S7), предполагают взаимодействие DOX и Mito-Q с гемом (рис. S7). В настоящее время мы не полностью понимаем механизм подавления экспрессии субъединицы C c O. Ранее было показано, что субъединица Va C c O играет важную роль в процессе переноса электронов в митохондриях (49).Текущие исследования показывают, что Mito-Q усиливает противоопухолевую активность DOX в клетках рака молочной железы (MCF-7 и MD-MAB-231), но защищает от токсичности DOX в кардиомиоцитах крысы (H9c2). Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что Mito-Q является подходящим лекарством-кандидатом для комбинированной терапии с DOX при лечении рака груди (56).

Таким образом, мы показали здесь, что метод низкотемпературного ЭПР ex vivo может быть использован в качестве эффективного аналитического инструмента для исследования изменений митохондриальных гемовых белков и гемовых центров в тканях миокарда во время кардиомиопатии, индуцированной DOX.Данные ЭПР показывают, что длительная обработка DOX расщепляет гем — биядерный активный центр ₃ / Cu _B субъединицы I C c O, который участвует в связывании кислорода. В соответствии с этим, активность C c O и экспрессия субъединиц C c O (C c O II и C c O Va) снизились во время обработки DOX, но были в значительной степени восстановлены Mito-Q. Таким образом, наши данные, демонстрирующие избирательные изменения активного центра C c O под действием DOX и восстановление экспрессии субъединицы C c O под действием Mito-Q, могут иметь механистическое значение для уменьшения кардиотоксичности, вызванной DOX.

Приложение A

Модифицированный синтез Mito-Q

Mito-Q был первоначально синтезирован Мерфи и его сотрудниками (30). Поскольку это соединение коммерчески недоступно, мы решили синтезировать его собственными силами. Хотя мы получили несколько миллиграммов чистого Mito-Q, используя опубликованные процедуры (30), процедура синтеза была утомительной, а выходы реакции были значительно низкими. Теперь мы изменили процедуру, и с помощью новой процедуры, разработанной в нашей лаборатории, мы можем генерировать чистый Mito-Q в граммах для экспериментов in vivo.Рис. S1 описывает измененную процедуру. Общий выход модифицированного синтетического пути близок к 80%. Мы внесли следующие изменения в опубликованные процедуры. Основное различие между нашим путем синтеза Mito-Q (рис. S1) и опубликованным путем заключается в синтезе промежуточного бромидебенона из идебенона (этапы 1 и 2). Опубликованный способ получения бромидебенона с участием тетрабромида углерода и трифенилфосфина привел к образованию Mito-Q с низким выходом, что потребовало обширной очистки.Предлагаемый метод (этапы 1 и 2 на рис. S1) дал чистое производное бромидебенона, и выход является количественным. Бромидебенон использовали на последующих стадиях без дополнительной очистки. Благодаря этим модификациям общий выход Mito-Q составил 83%. Анализ высокоэффективной жидкостной хроматографии Mito-Q на колонке C-18 с использованием смеси воды и ацетонитрила (градиентный поток 60-80% при скорости потока 1 мл / мин) показал единственный пик при удерживании 14,5 мин. время.

Протокол эксперимента

DOX-индуцированная кардиомиопатия на модели крысы показана на рис.S2.

Спектры ЭПР, зависящие от мощности микроволн и температуры

Спектры ЭПР при различных мощностях микроволн в диапазоне от 0,1 мВт до 150 мВт были исследованы во время индуцированных DOX / Mito-Q изменений структурных и магнитных взаимодействий / окружения вокруг интересующего металлического спинового центра. . Было проанализировано поведение ЭПР-релаксации сигналов высоко- и низкоспинового гема и 3Fe-4S (см. Уравнение S1), а параметры насыщения мощности перечислены в таблице S2. Типичные кривые насыщения мощности, полученные для низкоспинового гема для контрольной ткани сердца, образцов, обработанных DOX и Mito-Q, показаны на рис.S4. Значения P _1/2 высокоспинового гема и 3Fe4S были сопоставимы по величине для образцов тканей, обработанных нативным и DOX, соответственно. Это указывает на то, что их релаксационные свойства существенно не изменились в присутствии DOX и DOX плюс Mito-Q. Однако значения P _1/2 низкоспинового гема показывают трехкратное снижение по сравнению с нативным состоянием.

На рис. S5 показаны зависящие от температуры сигналы ЭПР высокоспинового гема ( г _z = 6.0), кластер 3Fe-4S ( г _z = 2,015), кластер 4Fe-4S ( г _z = 1,95) и низкий спин ( г _z = 3,0) для контрольной ткани сердца и группа, обработанная DOX, представлена ​​как зависимость амплитуды сигнала от температуры. Относительные высоты пиков, построенные для сигналов контроля g _z = 6,0 и группы, обработанной DOX, в сравнении с 1 / T дают линейные графики, показывающие, что сигналы подчиняются закону Кюри (сигнал = a / T + б ).Температурная зависимость сигнала при g = 2.015 типична для поведения кластеров 3Fe4S, демонстрирующих высокую интенсивность сигнала ЭПР при 10 К, снижающуюся до базового уровня при ∼35 К (57). Выше 35 К остаточный сигнал представляет собой лишь небольшой свободный радикал при г = 2,003. На вставке на рис. S5 показан график Кюри для контрольных и обработанных DOX образцов для сигнала при g _z = 3,0, построенный как зависимость амплитуды сигнала от температуры в зависимости от температуры.

Взаимодействие DOX или Mito-Q с гемином

Рис.S6 показывает экспериментальный и смоделированный спектры ЭПР C c O. Наше приписывание спектров ЭПР тканей миокарда подтверждается этими данными. Рис. S7, A и B поддерживают предположение о том, что как DOX, так и Mito-Q взаимодействуют с гемом, как видно по спектральным (рис. S7) и оптическим спектроскопическим (рис. S7, вставка ) изменениям.

DOX-опосредованный фиброз и апоптоз: действие Mito-Q

Рис. S8 и S9 показывают эффекты Mito-Q на индуцированный DOX фиброз и апоптоз в сердечных тканях.Как показано, Mito-Q ингибирует индуцированный DOX фиброз (фиг. S8) и апоптоз (фиг. S9 A ) и восстанавливает активность комплекса IV (фиг. S9 B ) в тканях сердца, выделенных от крыс, получавших DOX.

Мошенничество с грузовыми перевозками: набирающая обороты схема двойного посредничества, такая как «удари мола»

P , статья 1 двухчастного расследования предполагаемой схемы двойного посредничества в Южной Калифорнии
Вы можете прочитать Часть II здесь .

Разочарованный тем, что брокеры и перевозчики были разграблены сложной сетью мошенников, выдающих себя за законные компании, Джо Ховард создал электронную таблицу для отслеживания списка подозрительных компаний, в основном базирующихся в Южной Калифорнии, чтобы предупредить других о необходимости проявить должную осмотрительность или заплатить цену.

Когда он начал проект два года назад, Ховард, который работает в логистической компании на Среднем Западе, которую он просил не называть, сказал, что в его списке всего несколько компаний, с которыми следует избегать контактов.Сейчас он вырос почти до 500.

«Меня никогда не обжигали, потому что мы небольшая компания и очень осторожны со всеми, кого используем», — сказал Ховард FreightWaves. «Тем не менее, они ежедневно сжигают несколько брокеров с абсолютно нулевыми последствиями, и многие брокеры слишком заняты или слишком велики, или, может быть, немного ленивы, чтобы действительно провести некоторое исследование каждого номера MC [автомобильного перевозчика], который им бросают. ”

Говард сказал, что предполагаемая сеть двойных брокеров первоначально началась с трех крупных брокерских компаний, которые все еще работают — All State Association, расположенной в Сан-Фернандо, Калифорния, и Brokerage Brokerage и TriStar Brokerage, штаб-квартиры которых находятся в Глендейле, Калифорния.Ни одна из компаний не ответила на запрос FreightWaves о комментариях.

Эти три брокерских конторы используют тщательно продуманную сеть сотрудников и поддельные номера MC перевозчика, чтобы «притвориться, что у них есть грузовик, чтобы они могли перепродавать грузы», — утверждает Ховард. Он утверждает, что они были сняты с доски загрузки DAT в Орегоне в декабре после того, как брокеры подали многочисленные жалобы.

«Некоторым из нас это очень понравилось. Однако мы знаем, что они в конечном итоге вернутся с другими именами », — сказал он FreightWaves.«Это было большим событием для многих брокеров, которых ежедневно преследовали сотрудники этих компаний. Они были безжалостны, звонили до 10 раз в день и отправляли несколько электронных писем каждый раз, когда мы рекламировали фрахт на DAT. Как и многие другие брокеры, мы просто блокируем телефонные номера из этих кодов городов ».

DAT Аннабель Ривз заявила, что компании известно о том, что в отрасли происходит мошенничество с двойным посредничеством, и «DAT относится к этому очень серьезно».

«Двойная брокерская деятельность нарушает ряд государственных и федеральных законов, и если нам станет известно о таком поведении и будет предоставлена ​​достаточная информация, мы обратимся в соответствующие правоохранительные органы или посоветуем тем, кто обратил на это наше внимание, связаться с соответствующими органами, если им было удобнее делать это », — сказал Ривз FreightWaves.

Она отказалась комментировать, были ли исключены из правления DAT брокерские конторы Южной Калифорнии, о которых говорил Ховард.

Однако вскоре после того, как этим организациям было запрещено конкурировать за загрузку DAT, Ховард утверждает, что появились две новые брокерские компании — все они принадлежат Massive 3PL Corp. со штаб-квартирой в Эдинбурге, штат Техас, и Fargo Freight Inc. в Ла-Кресенте, штат Калифорния.

«Это просто бывшие сотрудники и менеджеры All State, Broadway и TriStar, использующие разные личности и работающие вместе», — говорит Ховард.

Было подано несколько жалоб на All State, Broadway и TriStar, а также на Massive 3PL за «несанкционированное повторное посредничество или проблемы с оплатой», согласно отчетам Carrier411 FreightGuard и Watchdog Ассоциации транспортных посредников (TIA).

Сурен Арустамян, менеджер Massive 3PL, не отвечал на телефонные звонки и электронные письма FreightWaves с просьбой прокомментировать ситуацию.

Fargo Freight также собрала несколько жалоб на несанкционированную перепродажу грузов и неплатежей перевозчикам.Никто в Fargo Freight не отвечал на телефонные звонки или электронные письма FreightWaves. В La Crescenta зарегистрировано 11 брокерских контор и перевозчиков, восемь из которых расположены на бульваре Предгорья в городе с населением около 20 000 человек.

Сеть, базирующаяся в основном в Южной Калифорнии

В Южной Калифорнии, по словам Говарда, в городах Глендейл, Туджанга, Северный Голливуд и Бербанк «может быть от пяти до 10 законных автотранспортных компаний», но он сказал, что там зарегистрировано более 400 MC. Он утверждает, что большинство организаций и сотрудников, вовлеченных в предполагаемую схему двойного посредничества, «так или иначе связаны друг с другом», и их можно проследить до его первоначального списка.

«Это определенно самая сложная операция, которую я видел за 20 лет работы в сфере логистики», — сказал Ховард.«Я поделился этой информацией с несколькими брокерами и ежедневно получаю несколько запросов на получение списка».

Тем не менее, он сказал, что некоторые игнорируют или удаляют список, не читая его, и заканчивают тем, что грузы отправляются с двойным посредничеством без разрешения, иначе их груз будет взят в заложники, пропадет без вести или поврежден.

Ховард сказал, что он также поделился своим списком с Федеральным управлением безопасности автотранспортных средств (FMCSA) в надежде закрыть сеть мошенников с загрузочной доской.

FMCSA не ответила на запрос FreightWaves о комментарии.

Как это работает

Ховард говорит, что эта тщательно разработанная сеть создала сотни поддельных номеров MC, притворяясь, что у них есть грузовики, чтобы получать грузы от других брокеров. Другая организация, участвующая в предполагаемой схеме, перепродает фрахт законным перевозчикам, которые часто даже не подозревают, что фрахт был незаконным с двойным посредничеством.

Как только законный перевозчик забирает груз, Ховард сказал, что предполагаемые мошенники часто требуют оплаты от брокера, у которого они забронировали груз, за ​​транспортные услуги или запрашивают ссуды на топливо у брокеров до того, как их схема несанкционированного повторного брокерства будет обнаружена.Часто легальные автотранспортные компании, которые перевозят груз, практически не общаются с грузоотправителями, которые не давали разрешения на двойное посредничество, и иногда вынуждены бороться, чтобы получить деньги, если они вообще есть.

Дейл Ленц, владелец небольшой автотранспортной компании и брокерской компании Story Express в Эймсе, штат Айова, сказал, что в основном у него есть специальные счета. Но иногда, по словам Ленца, когда он публикует нагрузку на DAT, его забивают телефонными звонками из кодов регионов Южной Калифорнии, которые связаны с растущим списком Ховарда.

«Двойное посредничество в том или ином аспекте существовало всегда, но оно гораздо более организовано, чем все, что я когда-либо видел раньше, и я занимаюсь бизнесом более 20 лет», — сказал Ленц FreightWaves. «Имеет место широко распространенное мошенничество, когда подставные перевозчики бронируют грузы у брокеров, а затем подвергают их двойному посредничеству».

Жертвы мошенников с загрузочной доской должны заполнить подробные отчеты, чтобы, возможно, это не случилось с другими, сказал Ленц.

«Мошенники получают легитимность, когда им разрешают находиться на грузовых досках», — сказал Ленц.«Раньше было, если они были на доске, они в основном были легальными. Что ж, на самом деле это уже не так ».

Carrier411 Даррен Брюэр сказал FreightWaves, что, по его оценке, эти мошенничества с двойным посредничеством, включая мошеннические ссуды на топливо, обходятся транспортной отрасли более чем в 100 миллионов долларов в год.

Брюера, которая позволяет брокерам и грузоотправителям изучать и контролировать автотранспортные компании на основе показателей безопасности, соответствия, производительности и транспортных показателей, тщательно контролирует свой сайт, чтобы предотвратить мошенничество с двойным посредничеством.

«Посредством отчетов FreightGuard от Carrier411 брокеры и грузоотправители могут сообщать о проблемах с определенными перевозчиками», — сказал Брюэр FreightWaves. «Это позволяет пользователям отслеживать и контролировать операторов, которые в прошлом участвовали в двойных брокерских операциях».

Он сказал, что Carrier411 использует собственные данные для анализа автотранспортных компаний по всей территории Соединенных Штатов на основе различных уровней риска заявленной деятельности, такой как двойное посредничество, удержание грузов в заложниках и обратное вымогательство.

Его сайт также отслеживает всех новых заявителей и новые номера MC, ежедневно выпускаемые Федеральным управлением безопасности автотранспортных средств (FMCSA), которые он использует для определения перевозчиков-хамелеонов, которые подают заявки на получение нового управляющего органа.

«Используя архивные данные, начиная с 2005 года, и инструменты предотвращения мошенничества, брокеры и грузоотправители могут идентифицировать перевозчиков-хамелеонов, которые могут действовать незаконно, используя новую личность и новый номер MC, чтобы скрыть свою прежнюю личность и избежать принудительных мер, направленных против них. FMCSA, — сказал Брюэр.

Несмотря на его непрекращающуюся борьбу за предотвращение мошенничества с двойным посредничеством, Ховард сказал, что новые номера MC, базирующиеся в Южной Калифорнии, появляются ежемесячно по мере того, как он собирает данные и связывает точки между сотрудниками старых и вновь созданных организаций.