Анатолий дудаль 35: Список поступающих, не набравших минимальное количество баллов ЕГЭ и не допускающихся к дальнейшему участию в конкурсе, а также отказавшихся от участия в конкурсе

Список поступающих, не набравших минимальное количество баллов ЕГЭ и не допускающихся к дальнейшему участию в конкурсе, а также отказавшихся от участия в конкурсе

Архив(2014  2015 2016 2017 2018)

2019 год:

 

1.            Аушев Харон Адамович

2.            Башилов Никита Владимирович

3.            Белов Дмитрий Вячеславович

4.            Берестяк Вероника Петровна

5.            Бужинский Андрей Геннадьевич

6.            Буханов Андрей Романович

7.            Бухаров Юрий Александрович

8.            Ванжа Александр Андреевич

9.            Ванжа Евгений Андреевич

10.       Веряскин Егор Анатольевич

11.       Ветхов Николай Павлович

12.       Виноградов Антон Евгеньевич

13.       Волгин Алексей Дмитриевич

14.       Волынский Сергей Сергеевич

15.       Герасин Даниил Александрович

16.        Гриднев Владимир Сергеевич

17.       Дементьева Оксана Дмитриевна

18.       Дудаль Артем Владимирович

19.       Елизарова Анастасия Анатольевна

20.       Ермошкина Софья Павловна

21.       Ефремов Антон Дмитриевич

22.       Ждакаев Иван Иванович

23.       Железнов Илья Алексеевич

24.       Жувага Максим Андреевич

25.       Жур Екатерина Алексеевна

26.       Иванов Даниил Александрович

27.       Кирсанова Екатерина Анатольевна

28.       Колмакова Ольга Сергеевна

29.       Краснослободцева Арина Сергеевна

30.       Купцова Анастасия Андреевна

31.       Курбанаева Алеся Александровна

32.       Куров Анатолий Вячеславович

33.       Кустов Данила Игоревич

34.       Лагаев Иван Константинович

35.

       Лахова Анастасия Юрьевна

36.       Лебедев Валентин Александрович

37.       Лебедько Виктория Анатольевна

38.       Лихачев Александр Петрович

39.       Люлюкина Анастасия Дмитриевна

40.       Майер Юрий Александрович

41.       Мамедов Эльнур Фахраддин оглы

42.       Мамонтов Егор Алексеевич

43.       Маргиева Венера Джемаловна

44.       Марченко Андрей Русланович

45.       Маслова Елизавета Игоревна

46.       Махмудова Диана Камильбековна

47.       Махортов Даниил Сергеевич

48.       Медведев Павел Викторович

49.          Моисеева Полина Сергеевна

50.       Мохов Артемий Александрович

51.       Мочалова Полина Дмитриевна

52.       Овчинников Александр Евгеньевич

53.       Пальчуковский Ярослав Дмитриевич

54.       Пикозов Артем Андреевич

55.       Познякова Екатерина Николаевна

56.        Потемкин Александр Станиславович

57.       Пушкарев Владислав Евгеньевич

58.       Резник Владислав Владимирович

59.       Романов Денис Владимирович

60.       Свиридова Дарья Сергеевна

61.       Смольянинов Николай Андреевич

62.       Солодухина Марина Максимовна

63.       Телегина Дарья Дмитриевна

64.       Телятникова Анастасия Сергеевна

65.       Титов Макар Андреевич

66.       Тихомирова Вита Михайловна

67.       Тихонов Денис Дмитриевич

68.       Торбушина Анна Вячеславовна

69.       Фатеева Анна Александровна

70.       Ханиев Казбек Магометович

71.          Хинеева Алина Николаевна

72.       Целлер Александр Владимирович

73.       Чаркин Александр Владимирович

74.       Черемных Данил Сергеевич

75.        Чернов Владислав Алексеевич

76.       Чернышов Никита Владимирович

77.       Чихладзе Дарья Николаевна

78.       Шенкевич Артем Валерьевич

79.       Шурупов Александр Дмитриевич

80.       Щитов Дмитрий Сергеевич

Научные публикации – Санкт-Петербургская академия СК РФ

Информация для опубликования научных статей в журнале «ВЕСТНИК АКАДЕМИИ ПРАВООХРАНИТЕЛЬНЫХ ОРГАНОВ» Академии правоохранительных органов при Генеральной прокуратуре Республики Казахстан

Академия правоохранительных органов при Генеральной прокуратуре Республики Казахстан сообщает о деятельности научного журнала Академии «Вестник Академии правоохранительных органов»

(далее – Вестник). Издается с 2016 года, периодичность издания – 4 раза в год, языки публикации – казахский, русский и английский.

Основная цель деятельности Вестника – освещение актуальных вопросов надзорной, судебной и следственной практики, оперативно-розыскной деятельности, правоведения, а также результатов научных исследований в сфере правоохранительной деятельности.

Вестник включен в Перечень изданий, рекомендуемых для публикации основных результатов научной деятельности (приказ № 396 МОН РК от 17 апреля 2019 г.), в Казахстанскую базу цитирования (КазБЦ) (договор №6 от 28.05.2020 г.) и в Российскую национальную библиографическую базу данных научного цитирования (РИНЦ) (договор № 108-03/2020 от 20.03.2020 г.).

Рубрики журнала: Теория и история государства и права; Конституционное и административное право; Гражданское и гражданско-процессуальное право; Уголовное право и криминология, уголовно-исполнительное право; Уголовный процесс, криминалистика, судебно-экспертная деятельность, оперативно-розыскная деятельность; Теория и практика прокурорского надзора; Деятельность правоохранительных и иных государственных органов; Исследования в сфере педагогики, психологии и социально-экономических наук; Международное право и сравнительное правоведение.

Информация о требованиях к статьям, по рецензированию и порядке рассмотрения статей размещена на официальном сайте Вестника (vestnikacademy. kz).

Материалы направляются на е-mail: [email protected],   [email protected], [email protected]. Почтовый адрес: Республика Казахстан, 021804, Акмолинская область, Целиноградский район, село Косшы, улица Республика, 16, Академия правоохранительных органов при Генеральной прокуратуре Республики Казахстан.

Контактные телефоны: +7 701 232 99 35 (WhatsApp), +7 701 442 02 42 (WhatsApp).

Смерть ко дню рождения – Газета Коммерсантъ № 76 (4131) от 28.04.2009

Вчера в Москве начальник ОВД «Царицыно» майор милиции Денис Евсюков, находясь в состоянии сильного алкогольного опьянения, устроил бойню в супермаркете «Остров», открыв в торговом зале стрельбу по покупателям и персоналу. В результате три человека убиты, шестеро ранены. Милиционер задержан и арестован Симоновским судом Москвы. Руководство столичной милиции считает, что у майора тяжелое психическое расстройство. Интересно, что пистолет, из которого стрелял господин Евсюков, находился в розыске: в 2000 году он был утерян другим нетрезвым сотрудником милиции, возвращавшимся из командировки с Северного Кавказа.

«Ночью 27 апреля примерно в 0.30 начальник ОВД «Царицыно» Денис Евсюков открыл стрельбу в супермаркете «Остров» на улице Шипиловской в Южном административном округе Москвы. В результате убиты девушка-кассир и мужчина, еще семь человек получили огнестрельные ранения различной степени тяжести»,— сообщил вчера официальный представитель следственного комитета при прокуратуре РФ Владимир Маркин. Позднее число погибших достигло трех человек: один из раненых скончался в больнице. По словам господина Маркина, по факту этого преступления возбуждено уголовное дело по ч. 2 ст. 105 «Убийство двух и более лиц» УК РФ. Расследование дела взял под личный контроль руководитель следственного комитета при прокуратуре РФ Александр Бастрыкин, который вчера заявил, что «данные трагические события должны стать предметом профилактики, глубокого и тщательного изучения всех обстоятельств, приведших к ним».

Вчера Симоновский суд Москвы дал санкцию на арест Дениса Евсюкова. Вскоре ему предъявят официальное обвинение.

Следствие уже поминутно восстановило все, что происходило в супермаркете, а также события, предшествовавшие трагедии. Как рассказал «Ъ» один из участников расследования, 20 апреля майору Евсюкову исполнился 31 год. Празднование дня рождения милиционер растянул на неделю: начальник ОВД практически каждый день выпивал со знакомыми и друзьями, а ежевечерне ссорился с женой Кариной. Основные торжества были назначены на 26 апреля. В кафе «Авиньон» на Севанской улице милиционер заказал стол на 35 персон. В ходе торжества начальник ОВД опять напился и в очередной раз поссорился с женой. Выяснение отношений, участником которого стал также тесть милиционера, продолжилось и дома. В результате майор обругал родственников, прямо поверх гражданской одежды надел форменный китель и ушел.

На улице милиционер остановил Chevrolet Lanos, которым управлял 35-летний москвич Сергей Евтеев. Начальник ОВД попросил довезти его до работающего круглосуточно «Острова». Видимо, милиционеру показалось мало выпитого, и он намеревался купить еще спиртного.

Что произошло в машине, доподлинно известно только самому майору, который пока показаний не дает. Следствием лишь установлено, что на парковке супермаркета милиционер выстрелил водителю в грудь из пистолета. Позднее Сергей Евтеев скончался в машине скорой.

Дальнейшие события в деталях запечатлели многочисленные видеокамеры супермаркета. Милиционер вошел в магазин и подошел к единственной работавшей кассе. Увидев очередь, достал пистолет и открыл огонь. 30-летняя кассирша Эльмира Турдуева погибла сразу. Стоявшие в очереди люди стали разбегаться по торговому залу, пытаясь укрыться за прилавками и стеллажами с продуктами. Майор, внешне абсолютно спокойный, ходил по магазину и стрелял по людям. В какой-то момент у него закончились патроны, он достал запасную обойму, перезарядил пистолет и продолжил стрелять. В результате 18-летняя Ольга Беднова была ранена в ногу, 30-летний Антон Кондаков — в пах и левую ягодицу, 27-летний Сергей Тюхтий — в голову, 28-летняя Елена Дудаль — в область левой лопатки, 19-летняя Луиза Мухитдинова — в голову, 23-летняя Евгения Самородова — в живот и 18-летний Илья Герасименко — в голову и поясницу.

Последний вчера скончался в реанимации.

Помощь подоспела только через 15 минут. К магазину прибыл первый патрульный экипаж милиции. Увидев коллег, майор Евсюков несколько раз выстрелил и в их сторону. Милиционеры открыли ответный огонь. Начальник ОВД попытался скрыться: забежал за угол магазина и спрятался за пустыми ящиками. Но его обнаружили и разоружили. В пистолете майора Евсюкова оставалось еще три неиспользованных патрона.

В руководстве столичного ГУВД уверены, что причиной трагедии стало внезапное психическое расстройство начальника ОВД «Царицыно». «Я с ним разговаривал после задержания в 4 часа утра. Глаза у него были как плошки, он ничего не соображал, ничего не помнил, что произошло, только плакал»,— рассказал на месте происшествия начальник ГУВД Москвы Владимир Пронин. При этом генерал Пронин отметил, «что до этого происшествия майор Евсюков характеризовался только с положительной стороны». В милиции Денис Евсюков работал почти 14 лет. До назначения в ноябре прошлого года начальником ОВД «Царицыно» занимал должности начальника отдела вооружения и оперативно-розыскной части ОВД «Бирюлево Восточное», затем возглавлял криминальную милицию в ОВД «Чертаново Южное».

Версию о психическом расстройстве милиционера вчера поддержали и в МВД РФ: глава ведомства Рашид Нургалиев указал на необходимость «провести комплексное психиатрическое обследование» майора Евсюкова. Кроме этого, господин Нургалиев вчера направил в органы внутренних дел субъектов РФ указание «о повышении качества отбора кандидатов на службу в милицию и для назначения на руководящие должности и усилении требований к самим кандидатам» с требованием уделить особое внимание психическому здоровью отбираемых.

К выводам о психическом расстройстве милиционера вчера склонялись и в Госдуме РФ. При этом депутаты видят причину психического нездоровья сотрудников милиции в тяжелых нагрузках, маленьких зарплатах и прессинге со стороны журналистов. «В милиции сложилась очень непростая ситуация: нагрузки на ее сотрудников огромны, оплата труда хотя и выросла, но до сих пор несоизмерима с этими нагрузками. Кроме того, сотрудники органов внутренних дел подвергаются постоянной критике как со стороны своего начальства, так и со стороны СМИ. Они работают в прессинге, который не все выдерживают»,— заявил председатель комитета Госдумы по безопасности Владимир Васильев, ранее работавший заместителем министра внутренних дел. «Милиционеров буквально задергали, они несут службу без еды, без отдыха, потому что у нас то праздники, то акции оппозиции, то массовые мероприятия вроде футбольных матчей, конкурсов «Евровидения» и так далее. Неудивительно, что многие стремятся снять стресс алкоголем»,— поддержал коллегу по Госдуме заместитель председателя комитета по конституционному законодательству и государственному строительству Виктор Илюхин.

В то же время вчера стало известно, что предпосылка для бойни в московском супермаркете «Остров» была создана еще девять лет назад. Как оказалось, пистолет, из которого стрелял майор Евсюков, не был его табельным оружием, а находился в розыске. 5 июня 2000 года его на вокзале в Ростове-на-Дону потерял другой нетрезвый сотрудник милиции, который возвращался из командировки с Северного Кавказа. Каким образом утерянный пистолет попал к майору Евсюкову, предстоит выяснить следствию. Не исключено, что, работая в уголовном розыске, он изъял его у кого-то из задержанных преступников и не оформил. Теперь майор Евсюков кроме обвинения в убийстве двух и более лиц дополнительно будет обвинен еще и в незаконном приобретении и хранении оружия. По совокупности начальнику ОВД «Царицыно» грозит пожизненное заключение, но только если он будет признан вменяемым. В противном случае майора Евсюкова ждет длительное принудительное лечение, срок которого будут определять психиатры и суд.

Александр Ъ-Жеглов

Официальный интернет-портал Администрации Томской области — Ошибка

array
(
    'code' => 404
    'type' => 'CHttpException'
    'errorCode' => 0
    'message' => 'Невозможно обработать запрос \"uploads/ckfinder/314/userfiles/files/%d0%9c%d0%b5%d0%b6%d0%b2%d0%b5%d0%b4_%d1%8f%d0%bd%d0%b2%d0%b0%d1%80%d1%8c.xlsx\".'
    'file' => '/var/www/production/yii/framework/yiilite. php'
    'line' => 1803
    'trace' => '#0 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1719): CWebApplication->runController(\'uploads/ckfinde...\')
#1 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1236): CWebApplication->processRequest()
#2 /var/www/production/public/index.php(72): CApplication->run()
#3 {main}'
    'traces' => array
    (
        0 => array
        (
            'file' => '/var/www/production/yii/framework/yiilite.php'
            'line' => 1719
            'function' => 'runController'
            'class' => 'CWebApplication'
            'type' => '->'
            'args' => array
            (
                0 => 'uploads/ckfinder/314/userfiles/files/%d0%9c%d0%b5%d0%b6%d0%b2%d0%b5%d0%b4_%d1%8f%d0%bd%d0%b2%d0%b0%d1%80%d1%8c.xlsx'
            )
        )
        1 => array
        (
            'file' => '/var/www/production/yii/framework/yiilite. php'
            'line' => 1236
            'function' => 'processRequest'
            'class' => 'CWebApplication'
            'type' => '->'
            'args' => array()
        )
        2 => array
        (
            'file' => '/var/www/production/public/index.php'
            'line' => 72
            'function' => 'run'
            'class' => 'CApplication'
            'type' => '->'
            'args' => array()
        )
    )
) Официальный интернет-портал Администрации Томской области — Ошибка | Департамент цифровой трансформации Администрации Томской области

404

Просим прощения, ведутся технические работы

/var/www/production/yii/framework/yiilite.php at line 1803

#0 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1719): CWebApplication->runController('uploads/ckfinde. ..')
#1 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1236): CWebApplication->processRequest()
#2 /var/www/production/public/index.php(72): CApplication->run()
#3 {main}

Официальный интернет-портал Администрации Томской области — Ошибка

array
(
    'code' => 404
    'type' => 'CHttpException'
    'errorCode' => 0
    'message' => 'Невозможно обработать запрос \"uploads/ckfinder/314/userfiles/files/%d0%9c%d0%b5%d0%b6%d0%b2%d0%b5%d0%b4%20%d0%bd%d0%be%d1%8f%d0%b1%d1%80%d1%8c.xlsx\".'
    'file' => '/var/www/production/yii/framework/yiilite.php'
    'line' => 1803
    'trace' => '#0 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1719): CWebApplication->runController(\'uploads/ckfinde...\')
#1 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1236): CWebApplication->processRequest()
#2 /var/www/production/public/index.php(72): CApplication->run()
#3 {main}'
    'traces' => array
    (
        0 => array
        (
            'file' => '/var/www/production/yii/framework/yiilite. php'
            'line' => 1719
            'function' => 'runController'
            'class' => 'CWebApplication'
            'type' => '->'
            'args' => array
            (
                0 => 'uploads/ckfinder/314/userfiles/files/%d0%9c%d0%b5%d0%b6%d0%b2%d0%b5%d0%b4%20%d0%bd%d0%be%d1%8f%d0%b1%d1%80%d1%8c.xlsx'
            )
        )
        1 => array
        (
            'file' => '/var/www/production/yii/framework/yiilite.php'
            'line' => 1236
            'function' => 'processRequest'
            'class' => 'CWebApplication'
            'type' => '->'
            'args' => array()
        )
        2 => array
        (
            'file' => '/var/www/production/public/index.php'
            'line' => 72
            'function' => 'run'
            'class' => 'CApplication'
            'type' => '->'
            'args' => array()
        )
    )
) Официальный интернет-портал Администрации Томской области — Ошибка | Департамент цифровой трансформации Администрации Томской области

404

Просим прощения, ведутся технические работы

/var/www/production/yii/framework/yiilite. php at line 1803

#0 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1719): CWebApplication->runController('uploads/ckfinde...')
#1 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1236): CWebApplication->processRequest()
#2 /var/www/production/public/index.php(72): CApplication->run()
#3 {main}

Крымский Медуниверситет лихорадит – студенты требуют вернуть прежнего ректора / 10 декабря 2004 | Крым, Новости дня 10.12.04

Ректор, проректоры и деканы Крымского медицинского университета ушли в отставку. Как объяснили «Новому Региону» в ректорате вуза, у главы заведения Анатолия Бабанина закончился срок контракта с Минздравом и, согласно новому законодательству, ректор будет избираться трудовым коллективом университета, путем тайного голосования.

По словам исполняющей обязанности ректора Ларисы Дудаль, в ближайшее время будет объявлен конкурс, после проведения которого состояться выборы. «Мы не сомневаемся, что после выборов Анатолий Бабанин вернется на должность ректора», – заверила «Новый Регион» госпожа Дудаль.

В то же время студенты вуза обеспокоены сложившейся ситуацией. В университете, дабы избежать массовых протестов, проводятся разъяснительные работы.

На днях, во время такой разъяснительной встречи с иностранными студентами те устроили в аудитории настоящий митинг, скандируя «Виват Бабанин!»

Среди не менее обеспокоенных преподавателей популярна версия о том, что Бабанина решили «задвинуть», чтобы освободить место для нынешнего министра здравоохранения Украины Андрея Пидаева на случай, если его фамилии не окажется в списке нового состава Кабмина. Кстати, Пидаев, до ухода в Кабмин, работал в Крыму на должности главы Минздрава автономии.

Выборы ректора должны состояться в течение двух месяцев, то есть, после того, как уже, по всей видимости, станет известен новый состав украинского правительства.

Напомним, как сообщал «Новый Регион», Бабанин был в числе тех ректоров крымских вузов, которые в ноябре обратились к студентам страны с призывом отказаться от участия в протестных акциях и вернуться в учебные аудитории.

Ссылки по теме:

Ректорат крымских вузов призвал студентов не идти на поводу у политиков, не уважающих Конституцию >>>

Симферополь, Александра Новикова

Симферополь. Другие новости 10.12.04

В конце финансового года «грантоеды» «похоронили» черноморских дельфинов. / Виктор Ющенко: Принятие присяги, это моральный акт с избирателями. / На Украине появился новый-старый генпрокурор. Читать дальше

© 2004, «Новый Регион – Крым»

Что стало со взломанным офисом могилёвских социал-демократов? |

Ровно полгода назад силовики из неустановленного ведомства взломали железную дверь по адресу, где официально зарегистрирована могилёвская организация Белорусской социал-демократической партии (Грамады), вынесли оттуда вещи — и теперь даже непонятно, где они.

Всё произошло в самом центре Могилёва, в доме на пешеходной улице Ленинской. Правда, окна партийного офиса выходят не на фасадную часть, а во дворы. Но даже там бдительные сотрудники, как предполагается, милиции проявили рвение, увидев сочетание бело-красно-белого цвета. Причиной чрезвычайной придирчивости стал визит высокопоставленного чиновника из Минска накануне 25 марта, а результатом – вот это фото, облетевшее все белорусские СМИ:

Выпиливание замка из железной двери стало нормой в борьбе с протестной символикой, хотя несколько лет к ряду весь офис могилёвской ячейки БСДП (Грамада) был украшен национальными и партийными флагами. В последнем случае речь идёт об официально зарегистрированном Минюстом геральдическом символе.

В борьбе с инакомыслием никого из арендаторов не позвали — взлом происходил без присутствия представителей БСДП (Грамада). Руководство партии узнало о проникновении в офис неизвестных постфактум от арендодателя, предпринимателя Анатолия Аношкина.

Через день председатель областной организации БСДП (Грамада) Юрий Гриневецкий направил официальное заявление на имя начальника Ленинского РОВД Могилёва, требуя начать расследование. Он обратил внимание на то, что никто не уведомил руководство партии о необходимости открыть дверь, а в результате взлома двери и последовавшего обыска областной организации был нанесён материальный ущерб.

Из милиции пришёл ответ, говорит Юрий Гриневецкий, но был он не по сути предъявленных требований. В письме говорилось, что договор аренды помещения заключал Игорь Борисов (председатель БСДП (Грамада), а Юрий Гриневецкий «не представил установленных документов, которые дают право представлять права Игоря Борисова». На этом всё.

И по состоянию на сегодня, продолжает лидер могилёвских социал-демократов, через полгода после инцидента ничего милиционеры не отдали. Более того, нет даже никакого протокола изъятия. Кроме больших, официально зарегистрированных флагов, в офисе было множество другой партийной атрибутики – флажки, буклеты, стикеры, но сколько чего было изъято органами никто не знает.

«Конечно, это похоже чем-то на разбой», — говорит Юрий Гриневецкий. Но без документов совершенно нет возможности сформулировать требования о возврате. Ведь даже у арендодателя, поясняет он, не было ключей от офиса партии. После проведённого обыска Анатолий Аношкин лишь вынес с уже незакрывающегося помещения принтер и другие вещи, чтобы их не растащили.

А далее руководством партии было принято решение не форсировать эту тему из-за углубления политического кризиса в стране. За комментарием MSPRING.MEDIA обратился к председателю БСДП (Грамада) Игорю Борисову. Его ответ получился коротким и очень ёмко характеризующим ситуацию в стране:

“Наш комментарий очень простой. Позиция партии такова, что у нас нет уверенности, что при физическом контакте в райотделе милиции активистов партии не посадят на сутки, например, за неподчинение работнику милиции или по какой-либо другой изобретённой причине. В условиях правового дефолта мы решили беречь людей”.

БСДП (Грамада), Игорь Борисов, Анатолий Аношкин, Юрий Гриневецкий

Датчики

| Бесплатный полнотекстовый | Биотесты на основе флуоресцентной поляризации: New Horizons

1. Введение

В настоящее время активно разрабатываются и широко используются различные аналитические системы для обнаружения различных веществ на основе их способности связываться с молекулами селективных рецепторов (антител, аптамеров, лектинов и т. Д.) .) и генерировать детектируемый сигнал, индуцированный этим связыванием [1,2,3,4]. Таким сигналом может быть изменение цвета, флуоресценции, проводимости или другого свойства, вызванное меткой, включенной в обнаруженные комплексы.В большинстве случаев для эффективного обнаружения метки реализуются форматы анализа, которые включают отделение обнаруженных комплексов от непрореагировавших меченых молекул или компонентов тестируемого образца, которые могут повлиять на аналитический сигнал. Достижение этого разделения требует использования различных носителей и многоступенчатых манипуляций, таких как центрифугирование, промывка, что делает анализ трудоемким и трудоемким. В этом отношении несомненные преимущества имеют гомогенные неразделимые биоаналитические тест-системы.Однако отличить переплетенные и несвязанные метки в образце среды не всегда просто. Эта проблема может быть успешно решена флуоресцентными иммуноаналитическими методами, основанными на изменении интенсивности флуоресценции, прежде всего за счет эффекта резонансного переноса энергии флуоресценции или поляризации флуоресценции (FP) [5,6]. Режим, основанный на регистрации FP, кажется более эффективным, поскольку он меньше зависит от индивидуальных свойств взаимодействующих реагентов. Принцип флуоресцентного поляризационного иммуноанализа (FPIA) успешно применяется для решения многих аналитических задач.Еще в 1989 г. обзор разработок FPIA содержал 195 ссылок [7]. Методология FPIA успешно реализована во многих коммерческих аналитических системах. Хорошо изученные возможности и ограничения FPIA сделали его обычным методом, занимающим строго определенную нишу в ряде биоаналитических методов [5,8]. Zhang et al. [5] во всестороннем обзоре представили его детальную характеристику как средство обнаружения химических загрязнителей в пищевых продуктах и ​​анализах окружающей среды.

Однако недавние разработки показали, что FP может успешно применяться во многих форматах анализа, отличных от традиционного FPIA.Дальнейшее развитие темы требует систематизации и сравнительной оценки нововведений, предложенных в последнее время. Такому анализу и посвящен данный обзор, в котором приоритет отдается публикациям последних пяти лет.

2. Физические основы поляризации флуоресценции

Аналитическое использование FP основано на облучении реакционной смеси, содержащей меченые флуорофором молекулы, плоско-поляризованным светом и регистрации флуоресценции, которую вызывает это облучение. В растворе неупорядоченных молекул поляризованный свет предпочтительно будет поглощаться теми, осцилляторы поглощения которых параллельны плоскости поляризации.Если возбужденная молекула не меняет своей ориентации в пространстве перед испусканием, флуоресцентное излучение также будет поляризованным (Рисунок 1). Степень FP в такой системе описывается уравнением Перрина (Уравнение (1)):

1 / Р = 1 / Рo + [1 / Рo — 1/3] × [RT / V] × τ / η

(1)

где Р — зарегистрированная поляризация, Рo — максимальная поляризация, T — абсолютная температура, R — газовая постоянная, η — вязкость, τ — среднее время жизни возбужденного состояния флуорофора, V — молярный объем флуоресцентное вещество.Скорость, с которой возбужденная молекула меняет свою ориентацию в пространстве, зависит от времени вращательной релаксации (φ). Этот параметр связан с вязкостью среды (η), абсолютной температурой (T), молекулярным объемом (V) и газовой постоянной (R) уравнением (2): Следовательно, при фиксированных вязкости и температуре FP напрямую определяется пропорциональна молекулярному объему. Изменение этого объема может происходить через связывание или диссоциацию молекулярных комплексов, через разложение или через конформационные изменения в молекуле.Небольшие молекулы в водной среде вращаются очень быстро и между поглощением и испусканием с равной вероятностью принимают любую ориентацию, что приводит к полной деполяризации излучения. Большие молекулы и межмолекулярные комплексы частично сохраняют ту же ориентацию, что и при поглощении света, даже во время излучения [9]. Следовательно, их флуоресценция в значительной степени поляризована. FP характеризуется значением P:

Р = (Iv — Ih) / (Iv + Ih)

(3)

где Iv — вертикальная составляющая флуоресценции (параллельная пучку возбуждения), Ih — ее горизонтальная (перпендикулярная) составляющая.Также используется другой параметр, связанный с FP, а именно анизотропия флуоресценции (FA), которая определяется следующим уравнением:

FА = (Iv — Ih) / (Iv + 2Ih).

(4)

Как и любой аналитический метод, FPIA имеет ряд недостатков. Во-первых, чувствительность FPIA ниже, чем у других иммунохимических методов. На результаты FPIA влияет матрица образцов. Для регистрации FP и FA требуются специальные устройства.

Вероятность поглощения поляризованного света зависит от угла наклона плоскости диполя флуорофора к оси поляризации света.Фотоселляция вызывает деполяризацию 3/5 светового потока. Угловое смещение диполей поглощения / излучения внутри флуорофора зависит от его структуры и также приводит к деполяризации света. Таким образом, даже если молекулы флуорофора неподвижны, FP / FA не может удовлетворять уравнению (1). Для любого флуорофора, произвольно распределенного в растворе, при однофотонном возбуждении FP изменяется в диапазоне 0,333–0,5, а FA — от −0,20 до 0,40 [9]. Третий параметр, который вносит существенный вклад в деполяризацию, — это величина подвижность, или, другими словами, вращательная диффузия молекул флуорофора в растворе.Именно вращательная диффузия флуорофора чувствительна к процессам комплексообразования. Из-за их высокой подвижности в растворе и небольшого размера молекул низкомолекулярные флуорофоры имеют высокий коэффициент вращательной диффузии. Когда низкомолекулярный флуорофор облучается плоскополяризованным светом, время жизни возбужденного состояния намного больше, чем время, необходимое для изменения ориентации молекулы в пространстве. Модуляция этого параметра является основой для разработки иммуноанализа поляризационной флуоресценции — см. Раздел 3.

3. Традиционный FPIA, его преимущества и недостатки

FPIA был впервые предложен Dandliker et al. [10]. Традиционный FPIA основан на конкурентном связывании специфических антител с тестируемым аналитом и аналитом, помеченным флуоресцентной меткой (индикатор). Реакционную смесь возбуждают поляризованным светом, и флуоресценцию измеряют в направлении, перпендикулярном лучу возбуждения. При возбуждении линейно поляризованным светом индикатор будет флуоресцировать деполяризованным светом, потому что к моменту излучения молекулы индикатора в растворе ориентированы случайным образом.Для комплекса антитело-индикатор вращение значительно замедляется, обеспечивая остаточную поляризацию излучаемого света (рис. 2). Следовательно, величина P зависит от соотношения связанных и свободных форм индикатора и определяется концентрацией исследуемого аналита. Степень изменения FP зависит от метки, среднего времени жизни молекулы в возбужденном состоянии, молекулярная масса аналита и природа комплекса. Поэтому выбор флуоресцентной метки имеет ключевое значение.Он должен иметь высокую интенсивность флуоресценции (т.е. высокий квантовый выход и большой коэффициент экстинкции), быть химически и фотостабильным в аналитических условиях, легко конъюгироваться с аналитом и не мешать взаимодействию лиганд-рецептор. Чтобы эндогенные гасители флуоресценции, присутствующие в образце, не мешали определению, их длины волн возбуждения и излучения должны отличаться от длин волн флуоресцентной метки. Кроме того, для уменьшения эффекта светорассеяния метка должна иметь большой стоксов сдвиг [5].Когда температура и вязкость раствора постоянны, FP будет зависеть только от размера флуоресцентной молекулы. В случае конкурентного анализа, чем выше концентрация рецептора, тем выше концентрация лиганда, необходимая для предотвращения образования меченого комплекса лиганд-рецептор, что приводит к ухудшению чувствительности анализа [5]. Соответственно, для достижения максимальной чувствительности необходимо использовать минимальное количество рецептора, которое обеспечивает надежную регистрацию изменения FP при переходе меченого лиганда в комплекс с рецептором.Наиболее часто используемый флуорофор — это изотиоцианат флуоресцеина (FITC). Включение FITC-содержащего производного антигена в иммунные комплексы приводит к значительным изменениям FP, как видно из рисунка 3.

FPIA — это гомогенный аналитический метод, не требующий разделения полученных соединений. Это позволяет определить концентрацию аналита в течение нескольких минут.

Метод FPIA характеризуется многими преимуществами, присущими иммунохимическим методам: например, универсальность для определения низкомолекулярных веществ (для многих из которых уже получены специфические антитела) или способность определять либо отдельные соединения, либо группу соединения в зависимости от специфичности используемых антител.Более того, FPIA имеет следующие уникальные особенности:

• Это простой гомогенный метод, не требующий стадий промывки и разделения.

• Время анализа ограничено только пипетированием, поскольку кинетическая константа связывания малых молекул аналита с антителами в растворе обычно варьируется от 10 ⁷ до 10 ⁸ 1 / M • s.

• Значение P — это относительный и безразмерный параметр, который сглаживает колебания в измерениях прибора и приводит к очень высокой воспроизводимости результатов.Коэффициенты вариации обычно не превышают 3–5%.

• Флуоресцентные метки можно довольно легко синтезировать, и они остаются стабильными при хранении в течение многих лет.

• Однако следующие особенности обычной FPIA следует рассматривать как ее недостатки.

• Анализ обычно требует высокой концентрации реагентов для надежных измерений FP; из-за этого FPIA менее чувствителен по сравнению с другими иммуноаналитическими методами.

• Некоторые соединения матрицы могут поглощать возбуждение и излучаемый свет, а также проявлять собственную флуоресценцию в той же спектральной области, что и используемый флуорофор; в результате результаты измерений искажаются.

• Метод может применяться только для обнаружения низкомолекулярных соединений, а также основан на значительной разнице молекулярных масс для меченного флуорофором антигена и его комплекса с антителом.

6.Флуоресцеин и альтернативные флуорофоры

Флуоресцеин и его производные по-прежнему являются наиболее часто используемыми флуорофорами в FPIA [5]. Хотя стоксов сдвиг флуоресцеина невелик (23 нм) и, следовательно, флуоресцеиновая метка очень чувствительна к светорассеянию и интенсивности фона, флуоресцеиновые красители занимают абсолютно доминирующее положение при обнаружении различных соединений с использованием FPIA. В нескольких обзорах обобщено использование флуоресцеина для обнаружения различных аналитов [5,8,63]. Выбор флуоресцеиновых красителей можно объяснить их прекрасными спектральными свойствами (время жизни флуоресценции 4.05 нс, квантовый выход 92%), унифицированные фильтры для длин волн поглощения / флуоресценции на всех анализаторах FP, химическая стабильность и возможность конъюгации с различными реактивными группами (сульфгидрильными, карбоксильными и аминогруппами). Карбоксифлуоресцеин (FAM), FITC, глициламинофлуоресцеин, флуоресцеинамин, 4 ‘- (аминометил) флуоресцеин, 4,6-дихлортриазиниламинофлуоресцеин и аминоацетамидо флуоресцеинамин являются используемыми флуоресцеиновыми красителями. Флуоресцеины характеризуются большим изменением поляризации излучаемого света и поэтому особенно подходят для FPIA.Также необходимо отметить незначительную фотолабильность в нормальных условиях, низкий температурный коэффициент флуоресценции (исключается необходимость контроля температуры) и высокий выход флуоресценции в связанном состоянии (30–60%). При облучении синим светом (с длиной волны 492 нм) молекула флуоресцеина переходит в возбужденное состояние, время жизни в котором составляет 4 нсэ, и излучает зеленый свет с максимальной длиной волны 517 нм. Если молекула флуоресцеина облучается плоско-поляризованным светом, она также будет излучать поляризованный свет.Степень FP будет зависеть от угла, на который молекула флуоресцеина вращается в течение времени между возбуждением и испусканием. Время вращения молекулы на угол приблизительно 68,5 ° определяется как время релаксации вращения, которое составляет 1 нс для небольшой молекулы флуоресцеина и 100 нс для больших молекул, таких как иммуноглобулин. Поскольку молекулы в растворе ориентированы случайным образом, результирующий FP будет приблизительно равен нулю, а для иммунного комплекса антитело-антиген, меченного флуоресцеином, FP будет большим.Помимо флуоресцеиновых красителей, в современных FPIA используются другие метки: родамин [45,64,65], BODiPY-FL [4,55], Alexa Fluor [66,67,68], Oregon Green [68] и другие. , большинство из которых имеют длины волн возбуждения / излучения, аналогичные флуоресцеину. Разработка новых флуорохромов имеет большой потенциал для улучшения аналитических параметров FPIA. Однако новые флуоресцентные красители должны быть адаптированы к текущей практике (например, красители должны быть доступны, должны быть разработаны методы маркировки и протоколы анализа, а применение нового красителя должно привести к повышению чувствительности).Имеют ли эти новые метки преимущества перед флуоресцеином, в настоящее время не совсем ясно, но индикаторы флуоресцеина, безусловно, дешевле и легче синтезировать. Благодаря своим фотофизическим свойствам родамин А может служить достойной альтернативой флуоресцеину. Как правило, производное родамина проявляет изменение цвета на розовый и излучает интенсивную флуоресценцию в кислой среде из-за активации карбонильной группы в спиролактоне или фрагменте спиролактама. Ли и др. [64] сообщили об анализе OTA аптамерным FA с использованием OTA, меченного лиссамином родамином B.Анализ основан на конкурентном связывании свободного OTA и его флуоресцентного производного с SA-конъюгированным аптамером. Было достигнуто значение LoD 10 нМ. Разработанный метод позволил обнаружить ОТА в образцах красного вина с добавками, что показало применимость анализа в сложных матрицах. Sun et al. разработали прямой тест на ЖК для обнаружения микотоксина афлатоксина B1 (AFB1) на основе его связывания с аптамером, имеющим единственный TMR-флуорофор на определенном участке [65]. Использование зонда аптамера, меченного TMR, позволило достичь LoD AFB1, равного 2 нМ, и подтвердило высокий потенциал в комплексном анализе образцов.Лю и др. [44] описали анализ кокаина на основе аптамера, помеченного в определенном положении с помощью TMR. Принцип анализа заключается в том, что взаимодействие кокаина и аптамера приводит к структурным изменениям TMR-меченного аптамера и, соответственно, изменениям во взаимодействиях между TMR-меченными и некоторыми основаниями G в последовательности аптамера. Следовательно, рост концентрации кокаина в исследуемой пробе приводит к сдвигу TMR FA. Разработанный анализ позволил контролировать содержание кокаина в пробах сыворотки и мочи с добавками; LoD кокаина составляла 5 мкМ.Использование красителя BODiPY-FL описано Guan et al. [55], где BODiPY-FL-NAN-190 применяли для контроля связывания лиганда с рецепторами 5-HT1A, экспрессируемыми в бакуловирусных частицах, с последующим увеличением FA. Zhang et al. [69] разработали FPIA для обнаружения эфиров фталевой кислоты в китайском спиртном, в качестве зонда использовалась жирная кислота с флуоресцентной меткой (C4-BODiPY-C9). Для 10 целевых аналитов LoD в спирте были ниже 11,2 мкМ. Терещенков и др. синтезировали производные макролидных антибиотиков с красителями флуоресцеин, BODiPY-FL, родамин, Alexa Fluor 488 и нитробензоксадиазол (NBD) [70].Для оценки связывания этих комплексов с рибосомами E. coli были оценены FP и константы диссоциации рибосом с антибиотиками. Показано, что производные BODiPY-FL и NBD применимы для скрининга связывания бактериальных рибосом с антимикробными препаратами. В исследовании Ванга и др. [66] Alexa Fluor 488 привлек большое внимание своими флуоресцентными свойствами, включая меньшее фотообесцвечивание и независимость от pH. Был разработан наноразмерный зонд для быстрого и чувствительного анализа нуклеиновых кислот, сконструированный из частично комплементарной двухцепочечной ДНК (дцДНК), используемой в качестве связующего звена между Alexa Fluor 488 и наночастицами золота (AuNP), что приводит к передаче поверхностной энергии.Конкурентное замещение зонда целевым аналитом уменьшало массу Alexa488, а восстановление флуоресценции уменьшало FP, что позволяло чувствительно оценивать целевую концентрацию и, таким образом, достигать определения уровня пМ одноцепочечных нуклеиновых кислот. Choi et al. [67] использовали анализ амплифицированного FP для измерения сродства человеческого ангиогенина и аптамера одноцепочечной ДНК. SA взаимодействует с аптамером биотинилированной одноцепочечной ДНК с последующим связыванием ангиогенина человека, меченного Alexa Fluor 488.Усиление сигнала FP с использованием модуля биотин-SA позволило достичь LoD 6,3 нМ. Jurewicz et al. [71] использовали краситель Alexa Fluor 488 в методе FP для оценки константы связывания пептида между субъединицей MHC-I β2m и флуоресцентно меченным пептидом. Laursen et al. [72] предложили для FPIA новый класс красителей — красители triangulenium — с комбинацией красного излучения и большого времени жизни флуоресценции. Они описали получение и очистку стабильных биоконъюгатов триангулена и обсудили аспекты их применения методов FP.Охаши и др. [73] сообщили о FPIA на основе вариабельного фрагмента одноцепочечного антитела Quenchbody (Q-body), меченного флуоресцентным красителем. После связывания с антигеном интенсивность флуоресценции Q-тела увеличивалась. Родамин 6G-подобный флуоресцентный краситель, ATTO 520, использовали для мечения Q-тельцов против BPA. После добавления антигена к Q-тельцу, меченному ATTO 520, реакция антиген-антитело привела к высвобождению красителя. Соответственно, более активное броуновское движение красителя вызвало более низкую FA. Влияние рассеянного света и эндогенных флуорофоров в образцах может привести к увеличению фоновой флуоресценции и ухудшить аналитические характеристики FPIA.Чтобы свести к минимуму это явление, было предложено использование флуорофоров с большей длиной волны возбуждения, чем у флуоресцеина, таких как комплексы переходных металлов (например, рутения и рения) [63,74,75]. Они флуоресцируют в диапазоне 630–700 нм и имеют большой стоксов сдвиг — до 250 нм. Использование этих флуорофоров позволяет не только снизить фоновый сигнал, но и определять высокомолекулярные соединения. Окада и Миноура [74] предложили флуоресцентный металлогликокластер рутения ([Ru (bpy-2Gal) (3)]) в качестве зонда FP для изучения связывания между углеводами и лектинами.Изменения ФП металлогликокластеров обнаружены после добавления лектинов. Таким образом, после добавления агглютинина арахиса значение FP увеличивалось. Предложенный подход позволил измерить константы диссоциации между металлогликокластерами и лектинами. Санчес-Мартинес и др. описывает определение глиадинов в пищевых продуктах без глютена в концентрациях до 0,09 мкг / мл [75]. Хелат рутения (II) в качестве флуоресцентной метки с длительным сроком жизни был использован в FPIA макромолекул глиадинов.Во время анализа целевой аналит вытесняет хелатный индикатор глиадин-Ru (II) из комплекса с антителом с последующим уменьшением FP пропорционально концентрации глиадина. Lo et al. [76] описали комплексы полипиридина и малеимида рения (1) в качестве тиол-специфических люминесцентных меток для бычьих и человеческих сывороточных альбуминов, глутатиона и тиолированного олигонуклеотида. Эти зонды демонстрируют сильно поляризованное излучение, длительный срок службы и высокие квантовые выходы, что делает их перспективными для использования в FPIA высокомолекулярных аналитов.В последнее время значительный прогресс в FPIA был достигнут за счет введения наночастиц в качестве усилителей. Chen et al. [8] описали FPIA на основе наноматериалов. Среди флуоресцентных наноматериалов, широко используемых в биосенсорике, есть квантовые точки (КТ). Сравнение с органическими красителями демонстрирует такие преимущества квантовых точек, как отличная фотостабильность, высокий квантовый выход и узкие спектры флуоресценции с заданными максимумами. В последние годы квантовые точки использовались в FPIA для обнаружения онкомаркеров [77,78], цистеина и ионов ртути [25], антитромбина [79] и аденозинтрифосфата (АТФ) [80], среди других.Помимо квантовых точек, нанокластеры меди использовались в FPIA для обнаружения вируса Citrus Tristeza [81], AuNP применялись в качестве индикаторов для чувствительного обнаружения ионов серебра [23], наночастиц кремнезема — для обнаружения тромбина [82] и углеродные наночастицы в сочетании с аптамером — для обнаружения апиразы в ЖК в реальном времени [83], а также в ближнем инфракрасном флуоресцентном красителе для обнаружения ципрофлоксацина [84].

7. FPIA для определения ионов металлов

Еще одна многообещающая область FPIA — определение ионов металлов.Известно множество методов количественного определения ионов металлов, но они довольно дороги и требуют специального оборудования. Кроме того, определение металлов в биологических образцах, в том числе из окружающей среды, требует большого объема образцов и специальной предварительной обработки. В качестве альтернативного метода можно предложить FPIA. Несколько исследований были посвящены разработке FPIA ионов серебра. Как известно, небольшие молекулы, в том числе ионы металлов, не могут производить существенных изменений FP. Чжан и Ван [85] разработали метод обнаружения Ag ⁺ , основанный на уменьшении FP.Для реализации этого подхода олигонуклеотиды, богатые гуанином, были помечены флуорофором TMR. Образование пары оснований G-Ag ⁺ -G привело к переходу от развернутой к складчатой ​​структуре, подобной шпильке. Это уменьшило взаимодействие между гуанином и TMR за счет фотоиндуцированного переноса электрона и, соответственно, уменьшение ответа FA. Разработанная тестовая система позволила измерить Ag ⁺ с LoD 0,5 нМ и динамическим диапазоном 2–100 нМ. В Wang et al. [86,87], ионы Ag ⁺ в водных растворах детектировались сенсором FP ​​с использованием AuNPs, функционализированных SH-ДНК.Анализ был основан на специфическом взаимодействии Ag ⁺ с несоответствием цитозин-цитозин (C – C) в дуплексах ДНК с последующим образованием стабильного опосредованного металлом цитозина – Ag ⁺ –цитозин (C – Ag ⁺ –C) пар оснований и, соответственно, изменение молекулярного объема и FP. Разработанная тест-система позволяет определять Ag ⁺ в течение 6 мин на наномолярном уровне. Qi et al. [88] разработали основанный на FP метод чувствительного обнаружения Ag ⁺ , основанный на использовании нанолистов MnO ₂ и взаимодействии лиганд-ДНК.Добавление Ag ⁺ к первоначально сформированному комплексу профлавин-ДНК приводило к высвобождению профлавина с последующим слабым изменением FP. Последующее добавление нанолистов MnO ₂ усилило изменения FP, что позволило количественно измерить Ag ⁺ . Достигнутая LoD составила 9,1 нМ при линейности 30–240 нМ. Этот биосенсор можно рекомендовать для анализа воды в окружающей среде. Jiang et al. [89] разработали высокочувствительный и специфический аптасенсор FP, основанный на усилении сигнала наночастицами серебра (AgNP) и предназначенный для обнаружения ионов ртути.Один из двух T-богатых аптамеров, содержащихся в аптасенсоре, был помечен КТ CdTe-CdS; другой был модифицирован с использованием AgNP в качестве усилителя. Связывание распознающего элемента с Hg ²⁺ в качестве целевого аналита привело к очевидному изменению FP. LoD для Hg ²⁺ составлял 6,6 нМ с аналитическим диапазоном от 10 нМ до 0,4 мкМ.

8. FPA нуклеиновых кислот

Анализ ДНК играет огромную роль в диагностике инфекционных заболеваний, идентификации людей при судебно-медицинской экспертизе и тестировании на отцовство, типировании тканей на гистосовместимость.Кроме того, только методы обнаружения ДНК позволяют получать однозначные результаты в масштабных генетических исследованиях, выявляющих аллели наследственных заболеваний [90,91]. Метод генотипирования широко используется в различных форматах высокочувствительного и специфического анализа [92]. Феномен FP был использован для исследования взаимодействия белок-ДНК и белок-белок, обнаружения ДНК путем амплификации смещения цепи и генотипирования путем гибридизации [93, 94]. Пока степень FP не стабилизируется, истинное значение линейно увеличивается до 10 кДа по молекулярной массе.Поскольку меченый флуорофором нуклеотид имеет молекулярную массу ~ 1 кДа, а флуоресцентный 25–30-мер — ~ 10 кДа, FP идеально подходит для фиксации реакции удлинения праймера. Chen et al. [95] предложили использовать эффект ингибирования флуоресценции ДНК и РНК катионного красителя в красной области нильского синего (NB). Предположение о том, что краситель служит интеркалятором для стопки пар оснований ДНК или РНК, было подтверждено различными исследованиями, такими как термическая денатурация, спектры поглощения и излучения. Линейный диапазон для определения ДНК составлял 3.0 нг / мл – 2,0 мкг / мл, а РНК — 27 нг / мл – 10 мкг / мл. LoD составляли 3,0 нг / мл и 27 нг / мл соответственно. Несмотря на широкое использование ddNTP, меченных красителем, в реакциях секвенирования [96] и полномасштабное исследование методов генотипирования с использованием протокола расширения праймера [97], первое использование FP для регистрации праймера элонгации было представлено только Chen et al. al. [95]. Эти эксперименты продемонстрировали простоту, высокую чувствительность и специфичность FP как метода регистрации удлинения праймера одной парой оснований в гомогенной реакции.FP при постоянной температуре и вязкости растворителя во многом зависит от молекулярной массы красителя. Фиксация флуоресцентного красителя FP позволяет регистрировать значительные изменения молекулярной массы молекулы без разделения или очистки [90]. Результаты показывают, что как FP, так и флуоресценция являются надежными и эффективными параметрами. Zhu et al. [98] описали новый метод PFA, основанный на усилении аптамеров и FP с помощью ssDNA-связывающего белка (SSB). Молекулы флуоресцеина и техасского красного вводили в различные части аптамера, что позволило получить 10 флуоресцентных индикаторов.Реакция аптамера с SSB приводила к резкому увеличению FP без целевого аналита из-за разной подвижности исходных молекул SSB и конечных комплексов SSB-краситель. Когда целевой аналит вступает в реакцию с аптамерами, образуется спиральная третичная структура комплекса, что приводит к высвобождению меченых нуклеиновых кислот из белка и сильному снижению FP. Gaus et al. [99] описали взаимодействие нуклеиновых кислот, которые были модифицированы с белками плазмы. Они использовали FP для измерения константы связывания 25 наиболее многочисленных белков плазмы человека с фосфоротиоатными модифицированными антисмысловыми олигонуклеотидами.Исследование показало, что антисмысловые олигонуклеотиды по большей части активно взаимодействуют с альбумином и гликопротеином, значительный процент которых представлен гистидинами. Wang et al. [66] продемонстрировали высокочувствительный анализ для обнаружения нуклеиновых кислот путем конкурентного связывания с FP. Частично комплементарная дцДНК использовалась в качестве связующего для AuNP и красителя Alexa Fluor 488. Это взаимодействие приводит к передаче поверхностной энергии от молекул красителя к AuNP. В то же время резкое уменьшение реальной концентрации красителя, отражающее репрессию ФП, с одновременным увеличением массы или объема комплекса приводит к увеличению времени релаксации вращения Alexa488, и, следовательно, , чтобы увеличить FP.Когда существует конкурентная замена между меткой и целевой нуклеиновой кислотой, происходит уменьшение массы или объема комплекса с Alexa488, и, следовательно, FP уменьшается. Этот эффект можно использовать для определения нуклеиновых кислот в концентрациях, не превышающих уровень пМ. Несмотря на сложность протекающих реакций, время анализа не превышает 30 мин. Никифоров и Джеонг [92] описывают устройство и метод обнаружения FP во время реакции нуклеиновой кислоты, такой как амплификация полимеразной цепной реакции (ПЦР) или изотермическая амплификация.ФП можно обнаружить одновременно в нескольких образцах. Кроме того, несколько флуорофоров можно использовать для обнаружения различных последовательностей в образце во время одной и той же реакции. Алексей и др. [100] изучали методы определения водорастворимых лигандов с большой молекулярной массой. Образцы лигандов конкурируют с флуоресцентно меченными пептидами за связывание. Присутствие лиганда и связывание с ним партнера оставляет меченые пептиды свободными для проявления деполяризации флуоресценции. Wu et al. [101] использовали FP для изучения взаимодействий и обнаружения молекул-мишеней.В этой работе FP эффективно использовался для демонстрации генотипирования системы мутаций, устойчивых к амплификации. В этой группе реакций аллель-специфические продукты ПЦР регистрировали путем гибридизации ампликон-специфичных последовательностей ДНК. Несмотря на надежность и чувствительность реакций гибридизации, реализация этого метода требует большого опыта в разработке целевых меток и протоколов для приложений генотипирования. В случае реакции удлинения праймера и его регистрации методом ФП условия реакции универсальны и практически не требуют оптимизации.

9. FP в мониторинге каталитических процессов

Конкурентный анализ FP, основанный на взаимодействии немодифицированных аналитов и флуоресцентно меченных аналогов (меток или индикаторов) для связывания со специфическими антителами, широко используется для тестирования ингибиторов ферментов как потенциальных новых лекарств. для противоопухолевой и антибактериальной терапии. ФП позволяет изучать избирательное ингибирование ферментативной активности (рис. 8). Одной из первых работ по использованию ФП для определения ферментативной активности была публикация Миуры 1985 г. [102] о регистрации активности лизоцима человека в моче.Анализ представляет собой реакцию между ферментом и субстратом, меченным флуоресцеином, что вызывает снижение FP. Это взаимодействие является гиперболическим в диапазоне концентраций лизоцима от 0,01 мг / л до 10,0 мг / L. Fiene et al. [103] представили ФП-анализ гидролазной активности. Гидролазы семейства эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролаз, среди которых следует выделить отдельно NTPDase1, -2, -3 и -8, играют важную роль в передаче пуринергических сигналов, посредством которых регулируются уровни внеклеточных нуклеотидов.Авторы разработали FPIA NTPDase, основанную на использовании АТФ или АДФ в качестве субстратов. Дефосфорилирование до АДФ катализируется NTPDase1 с последующим дефосфорилированием до аденозинмонофосфата (АМФ) в качестве конечного продукта. NTPDase3 и -8 продуцируют AMP и ADP, тогда как NTPDase2 в большей степени приводит к образованию ADP. FP-реакция обнаружения соответствующего продукта, AMP или ADP, происходит из-за замены соответствующего флуоресцентного индикаторного нуклеотида из специфического антитела.Эта реакция приводит к изменениям FP с LoD 20 мМ АТФ или 10 мМ АДФ, что ниже значений константы Михаэлиса (KM) для NTPDases. Kleman-Leyer et al. [104] предложили метод определения киназной активности путем прямого иммунодетектирования нуклеотидов с использованием платформы Transcreener ^® (BellBrook Labs, Мэдисон, штат Ви, США). В этой статье описывается создание антител с селективностью к АДФ по сравнению с АТФ более чем в 100 раз, что позволяет надежно определять начальные скорости при концентрациях АТФ в диапазоне от 0.От 1 мкМ до 1000 мкМ. Также представлен метод расчета KM киназы АТФ с использованием этого иммуноанализа FP. Предлагаемый метод является фундаментальным при скрининге ингибиторов и агентов селективности для любого фермента, продуцирующего АДФ. Биби и др. [105] изучили и идентифицировали закономерности между кинетическими функциями фосфорилирования различных субстратов EGFR дикого типа и онкогенных мутантов in vitro. Исследования показали, что изучаемые показатели различаются между видами EGFR. Природа различий кроется в субстрате.Эксперименты проводились с использованием FPIA, который эффективно выявляет отличительные нюансы фосфорилирования как пептидов, так и природных субстратов. Результаты согласуются с традиционным (γ-32P) АТФ / фильтрационным анализом. Su et al. [106] представили быстрый и чувствительный анализ метилтрансферазы с использованием конкурентного анализа FP. С той же целью Graves et al. [107] разработали высокопроизводительный конкурентный FPIA, основанный на определении продукта всех метилтрансферазных реакций — S-аденозилгомоцистеина (AdoHcy) с использованием S-аденозилметионина (AdoMet).В качестве распознающего агента использовали антитела Anti-AdoHcy. Конъюгат флуоресцеин-AdoHcy служил меткой. Это соединение конкурировало с AdoHcy, продуктом активности метилтрансферазы, за связывание с ферментом. В результате конкурентного взаимодействия увеличивается концентрация метки и, как следствие, уменьшается FP. Результаты анализа показали, что антитело более чем в 150 раз предпочтительнее для связывания AdoHcy, чем AdoMet. Mestas et al. [108] предложили простой высокопроизводительный анализ, основанный на FP, для определения активности элонгации полимераз нуклеиновых кислот.Анализ основан на межмолекулярном взаимодействии между 5′-меченной цепью матрицы и флуоресцентным красителем, которое вызывает изменение конформации нуклеиновой кислоты. Если олигонуклеотид достаточно короткий, FP также можно использовать для обнаружения связывания до активности элонгации. Полимеразный анализ позволяет проводить скрининг соединений, которые ингибируют активность связывания нуклеиновой кислоты или удлинения полимеразы.

10. На пути к мультиплексному анализу

Часто необходимы анализы нескольких соединений, имеющих схожую или различную химическую природу.Поэтому естественной тенденцией стало создание многопараметрических систем, которые активно привлекают внимание исследователей за счет коммерчески выгодного внедрения, которое снижает количество реагентов, общую стоимость анализа и время обнаружения. Одним из преимуществ FPIA является простота реализации многопараметрического анализа. Теоретически, чтобы реализовать этот подход для увеличения количества анализируемых соединений, достаточно определить дополнительный аналит в соседней лунке микропланшета, или добавить еще один флуорофор, или использовать группоспецифичные рецепторы.Несмотря на теоретическую простоту мультиплекса PFIA, на практике единичные работы были реализованы. Бородулева и соавт. [109] разработали FPIA для двух пестицидов, триазофоса и карбарила, в зернах пшеницы с использованием портативного прибора Ellie Sentry 200 FPIA. Использование этилендиамин-флуоресцеин-тиокарбамила в качестве красителя позволило повысить чувствительность анализа при минимальном расходе реагентов. Авторы разработали быструю и высокопроизводительную процедуру пробоподготовки для параллельного определения обоих аналитов в аликвотах одного и того же образца.LoD триазофоса и карбарила составляли 40 и 20 мкг / кг соответственно. Zhang et al. [110] описали реализацию мультиплексной FPIA для одновременного обнаружения трех пестицидов (триазофоса, паратиона и хлорпирифоса) в различных сельскохозяйственных продуктах. Авторы используют флуоресцентно меченые олигонуклеотиды в качестве индикатора и используют AuNP для повышения чувствительности анализа. Одновременно проводили реакцию со специфическими антителами и мечеными нуклеотидами, иммобилизованными на поверхности наночастиц.Использовали три красителя (6-FAM, Cy3 и техасский красный) с высокой интенсивностью флуоресценции и небольшим кроссовером длины волны возбуждения / испускания. Для этих трех аналитов LoD составляли 0,007, 0,009 и 0,087 мкг / л соответственно. Guan et al. [57] предложили конкурентный FPIA для одновременного мониторинга BPA и его аналогов с использованием Dex-FL в качестве красителя. В оптимизированных условиях были обнаружены четыре бисфенола в концентрациях, соответствующих требованиям Европейского Союза. FPIA показал LoD 0,08–0,49 мг / л для различных бисфенолов.Обладая высокой чувствительностью, разработанный анализ продемонстрировал хороший потенциал для быстрого скрининга бисфенолов в пище. Целью другого исследования [56] было одновременное обнаружение BPA и его аналогов. Разработанный FPIA продемонстрировал LoD 0,21–1,03 мкг / г для четырех соединений, что может соответствовать требованиям экологического мониторинга. В этом исследовании был получен рецепторный белок с широкой специфичностью для бисфенолов, который использовался для FPIA в образцах почвы. Ли и др. [111] описали гомологичный и высокопроизводительный многоволновый FPIA для множественного обнаружения трех микотоксинов рода Fusarium: дезоксиниваленола (DON), токсина T-2 и фумонизина B1 (FB1).В качестве индикаторов использовали три флуоресцентных красителя. Роль антигенсвязывающего компонента играли специфические антитела. В оптимальных условиях LoD составляли 242,0 мкг / кг для DON, 17,8 мкг / кг для токсина T-2 и 331,5 мкг / кг для FB1. Общее время анализа было менее 30 мин. Энантиоселективные анализы и сенсоры привлекли большое внимание для обнаружения энантиомерных примесей. Chovelon et al. [45] продемонстрировали ранее описанную стратегию анализа так называемого аптамерного комплекса поцелуев (AKC) и его возможную реализацию при одновременном количественном определении энантиомера и анализе энантиочистоты.D- и L-AVP использовали в качестве модельных энантиомерных мишеней. Сконструированные D- и L-AVP аптамеры (aptaswitches) использовали в качестве единиц распознавания, в то время как меченые флуоресцеином или Texas Red D- и L-шпильки (aptakiss) служили зондами для энантиомер-зависимого образования AKC. Передача сигнала ортогональной флуоресцентной анизотропии на двух длинах волн излучения позволила одновременно определять энантиомеры AVP в одном образце в формате высокопроизводительного микропланшета. Также было показано, что энантиоселективный сенсор AKC обнаруживает энантиомерные примеси до 0.01%.

11. Переключаемый FP и его аналитическое использование.

FP и FA обычно используются как два взаимозаменяемых метода. Сочетая в себе преимущества аптамеров как рецепторных агентов и ЖК, этот метод позволяет обнаруживать небольшие молекулы с более высокой чувствительностью и снимает некоторые ограничения, присущие традиционным форматам иммунных анализов. Анализы FA с переключением структуры аптамера для обнаружения низкомолекулярных соединений основаны на изменениях анизотропии, вызванных конкуренцией между связыванием аптамер-мишень и конформационно измененным комплексом аптамер-комплементарная ДНК (кДНК) [112].Значительное увеличение изменения FP происходит из-за большой разницы в скоростях вращения свободного аптамера и комплекса аптамер-кДНК (рис. 9).

Принцип переключения структуры аптамеров заключается в том, что экзонуклеаза I (Exo I) разрушает оцДНК в направлении от 3 ‘к 5’ и не влияет на дцДНК. Exo I играет главную роль в этой реакции, что делает его универсальным препаратом для обнаружения соединений разного размера и природы. Цепная реакция гибридизации (HCR) протекает без участия ферментов.Инициатор запускает каскад гибридизаций двух свободно используемых шпилек ДНК, в результате чего образуются длинные разрезы. Молекулярная масса продуктов HCR и концентрация инициатора напрямую связаны. Его способность иммобилизовать индикаторные молекулы на шпильках делает HCR многообещающим методом усиления сигнала в аналитических приложениях. Пока что целевая переработка Exo I и HCR получила широкое распространение. В статье не приводится экспериментального подтверждения одновременного использования аптамеров и двойной амплификации.Методы изотермического усиления оказались мощными и многообещающими инструментами, которые обеспечивают усиление с высокой эффективностью и высокой скоростью при постоянной температуре без термоциклирования.

Zhao et al. [27] рассмотрели самые последние достижения в определении аффинности с использованием аптамеров и FP. Большой интерес вызывают межмолекулярные взаимодействия и идентификация связывания. Используя FP, вы можете эффективно регистрировать связывание аптамеров ДНК с целевыми аналитами. Аптамеры обладают рядом преимуществ, скрининг аптасенсора с усилением сигнала основан на вышеописанной реакции, катализируемой экзонуклеазой I.Авторы предложили использовать этот принцип для определения антибиотика левомицетина. После того, как инициатор HCR блокирует аптамер-связывающий домен, аптамер изменяет свою третичную структуру в присутствии хлорамфеникола, что приводит к диссоциации ДНК. На следующем этапе высвободившийся аптамер распознается и расщепляется Exo I с высвобождением хлорамфеникола. В оптимальных условиях аптасенсор показывает линейный диапазон от 0,001 до 100 нМ хлорамфеникола и LoD 0,3 пМ. Perrier et al. [113] предложили новый аптамерный анализ на основе FP для определения низкомолекулярных антигенов.Олигонуклеотид-усилитель сигнала (SEO) служил детектором аналита. Нацеливаясь на определенные области сигнальных ДНК, связывание SEO со свободным аптамером вызывает нарушения как внутренней универсальности ДНК, так и локализованного окружения красителя, когда свободный аналит входит в дуплексную структуру. Этот эффект определяет увеличенную вариацию FP между дуплексным и целевым связанными состояниями аптамера. Авторы использовали флуоресцеин и красители Texas Red для регистрации предварительно структурированных (аденозин) и неструктурированных (тирозинамид) аптамеров.Li и Zhao [114] предложили анализ FP с аптамером, переключающим структуру, специфичным для микотоксина AFB1. Они использовали аптамер, меченный TMR, и его кДНК с тандемным удлинением оснований G в качестве метки для обнаружения. Такой подход позволяет достичь высокой чувствительности и селективности при обнаружении AFB1. Совместная гибридизация аптамера и кДНК приводит к тому, что TMR приближается к повторяющимся основаниям гуанина (G) и индуцирует высокое значение FP из-за взаимодействия TMR-G и ограниченного вращения TMR. Этот анализ выявил AFB1 с LoD 125 пМ и динамическим диапазоном от 125 пМ до 31.2 нМ. Воспользовавшись преимуществами аптамеров, Лю и Чжао [43] разработали простой и быстрый анализ FP для BPA. 35-мерный ДНК-аптамер против BPA играет важную роль в распознавании. Если в образце присутствует BPA, конформация TMR-меченного аптамера изменяется из-за взаимодействия гуанинового основания. Эта реакция приводит к изменению сигналов ТВС. LoD BPA составляла 0,5 мкмоль / л в оптимальных условиях. Ли и др. [64] предложили быстрый и чувствительный OTA, основанный на обнаружении FP и переключении аптамеров.Авторы синтезировали конъюгат OTA с родамином B, который использовали в качестве конкурента в анализе аптамеров на основе FP. Роль рецепторного агента выполнял ОТА-специфический аптамер, способный участвовать в включении и выключении сигнала. Для дальнейшего повышения чувствительности анализа авторы использовали молекулу SA для увеличения молекулярной массы и уменьшения скорости вращения меченого красителем агента. Такой подход обеспечил LoD 2,5 нМ и более заметное снижение FP. Кроме того, флуоресцентный зонд может взаимодействовать с твином 20, что приводит к более высокому FP, чем комплекс аптамер-флуоресцентный зонд.LoD OTA составлял 10 нМ. Li и Zhao [115] также использовали двухэтапную сенсибилизацию FP, потому что они одновременно использовали аптамер, переключающий структуру, и молекулы SA. Этот подход основан на эффекте близости для уменьшения вращения флуорофора. Образование комплекса аптамера с целевой низкой молекулярной массой вызывает смещение кДНК, меченной SA, что приводит к значительному снижению FP. Близость SA к FAM в дуплексе позволяет получить значительные изменения FP при определении низкомолекулярных соединений.Этот метод позволил детектировать 60 пМ AFB1, 1 нМ ОТА и 0,5 мкМ АТФ. Goux et al. [116] описали использование пептидных нуклеиновых кислот (ПНК) в качестве альтернативы ДНК-зондам в тестах флуоресцентной поляризации переключаемых аптамеров. Сначала они исследовали влияние длины цепи ПНК, природы красителя и условий буфера на эффективность анализа. В работе использовались два метода. Первый основан на гибридизации ПНК / аптамер. Второй основан на образовании комплекса аналит-маркер.Линейный диапазон для АТФ составляет от 1 до 25 мкМ, с LoD 3 мкМ, что в пять раз ниже, чем у конкурирующих моделей.

12. FPA с усилением сигнала

Несмотря на успешную реализацию и широкое использование анализа FP на основе аптамеров, этот метод не всегда удовлетворяет поставленным задачам по чувствительности. При использовании большинства ранее рассмотренных схем анализа принцип заключается в связывании распознающих молекул с крупными массовыми видами, что позволяет увеличить разницу FP между зондами без лиганда и зондами с лигандом.С этой целью можно интегрировать различные наноматериалы и белки, связывающие нуклеиновые кислоты. Мы обсудим эти различные стратегии ниже.

В последние годы было предложено множество подходов к снижению LoD. Однако важно, чтобы достижение этой цели не повлекло за собой значительного усложнения анализа и его интеграции со сложными и дорогостоящими инструментами. Когда требуются количественные результаты, для определения интенсивности оптического сигнала используются портативные оптические детекторы, камеры и смартфоны.Использование этих детекторов не сильно усложняет анализ. Как многообещающий подход, FP представляет собой универсальный и отличный инструмент для оценки скорости молекул молекул разной природы в однородной среде [8]. В отличие от интенсивности флуоресценции, FP практически не зависит от концентрации или количества флуорофоров, но сильно зависит от размера или молекулярной массы молекул с флуорофором. За последние 10 лет в области FP был проделан значительный объем работ с внедрением некоторых наноматериалов в качестве усилителей FP, что, таким образом, значительно улучшает чувствительность обнаружения, а FP на основе наноматериалов в настоящее время успешно используются в иммуноанализе белков, нуклеиновых кислот. , малые молекулы и ионы металлов.Nanomaterial FP представляет собой новый вид стратегии разработки флуоресцентных сенсоров. Методы основаны либо на ковалентно-биоаффинном комплексе, либо на адсорбционной иммобилизации рецепторных молекул на наноматериале [117].

12.1. Наночастицы как усилители сигнала

В настоящее время наноматериалы широко используются в аналитических целях [118]. Для конкретной цели анализа FP главное очевидное преимущество наноматериалов заключается в их высоких объемных характеристиках. Кроме того, наночастицы, обладая хорошо развитой поверхностью, легко поглощают не только крупные белки, но и мелкие нуклеиновые кислоты, такие как функциональные нуклеиновые кислоты (FNA) [119].Следует отметить две области применения наночастиц в системе FP для усиления аналитического сигнала. Во-первых, наноматериалы можно использовать напрямую для увеличения массы комплекса и, следовательно, уменьшения скорости вращения. Вторая роль наночастиц — перенос сигнальных маркеров посредством адсорбционной иммобилизации на их собственной поверхности. В этом разделе предлагается рассмотреть варианты использования наночастиц различной природы в аналитических системах FP, таких как AuNP, QD, углеродные частицы, магнитные наночастицы (MNP) и некоторые другие наноматериалы.Уникальные усилители FP представляют собой КТ, характеризующиеся длительным временем жизни флуоресценции, относительно небольшим размером, но большой массой. Таким образом, комплекс, образованный аптамером белок-КТ и дигоксин-АТФ, первоначально связывается со специфическим антителом. Вызванное аналитом смещение FP вызывает удаление рецептора, а затем уменьшение его массы [3]. Самохвалов и др. [120] предложили AuNP в качестве носителей для снижения LoD анализа аптамеров на основе FP. Данная работа демонстрирует преимущества AuNP как унифицированных, стабильных и просто модифицированных носителей аптамеров.Анализ выполняли с использованием AuNP со средним диаметром 8,7 нм и OTA в качестве целевого аналита. Наконец, тест был проверен на наличие контроля ОТА в ароматизированном белом вине. Достигнутая LoD составила 2,3 мкг / кг, что в 25 раз ниже, чем у нативного аптамера. Продолжительность анализа 15 мин. Ye et al. [121] предложили два варианта повышения чувствительности анализа аптамеров на основе FP. Аптамер оцДНК широкого спектра действия, способный связываться с четырьмя различными источниками липополисахаридов (ЛПС), был усечен.Полученные данные свидетельствуют о том, что аптамер из 27 нуклеотидов сохраняет способность к широкому классу соединений и имеет более высокое сродство. Анализ аптамера на основе оксида графена на основе FP с использованием аптамера, меченного FAM, может обнаруживать ЛПС из Salmonella entericaserotype typhimurium, Pseudomonas aeruginosa 10 и Escherichia coli 055: B5 с улучшенными характеристиками. Анализ можно сделать в течение 30 минут; LoD составляли 38,7, 88,0 и 154 нг / мл соответственно. Huang et al. [122] разработали два аптасенсора с FP-усилением. Предлагаемые сенсоры основаны на усилении сигнала ферментативным щелчком и нанодисперсным оксидом графена (GO), что позволяет регистрировать биомолекулы в растворе.Первый подход включает связывание аптамера с целевым аналитом посредством стабильного комплексообразования между рецептором аптамера и комплексом ДНК-флуорофор. Последний, в свою очередь, адсорбционно связывается с ГО и активно участвует в образовании дуплексной области ДНК, содержащей сайт захвата, за счет усиления стэкинга оснований. Во втором методе целевой аналит вызывает сборку двух субъединиц аптамера в комплекс аптамер-аналит с последующей гибридизацией с участием комплекса ДНК-флуорофор.Последний, в свою очередь, адсорбционно связывается с ГО и активно участвует в образовании дуплексной области ДНК, содержащей сайт захвата. Образование дуплексной области ДНК запускает процесс ферментативного щелчка, который приводит к высвобождению коротких фрагментов ДНК с красителем из ГО, вызывая значительное снижение FP. Используя этот подход, чувствительность анализа можно повысить на четыре порядка. Chen et al. [123] разработали аптасенсор FP на основе конъюгата MNP с полидофамином для обнаружения рекомбинантного человеческого эритропоэтина альфа (rHuEPO-α).Усиленный сигнал FP обусловлен высокими массами белка и MNP-PDA. Этот анализ можно использовать для разделения или повторного использования целей на основе магнитных свойств MNP – PDA. LoD rHuEPO-α составлял 0,12 пМ, что на четыре порядка ниже, чем в исходном анализе.

Несмотря на преимущества наночастиц, их использование для повышения чувствительности анализа FP имеет ограничения. К недостаткам наночастиц можно отнести неконтролируемый размер (разброс по массе). Они также способны в значительной степени гасить флуоресценцию, что серьезно снижает точность и чувствительность метода FP.Наноматериалы реализуют каскадное усиление за счет их совместного применения с белками.

12.2. Усиление сигнала на основе белков

Преимущества FPIA заключаются в том, что он выполняется за один этап с быстрыми взаимодействиями, не зависящими от диффузии, и что аналитический сигнал может быть записан непосредственно во время образования комплекса. Простота и скорость сделали этот метод популярным для решения различных исследовательских и прикладных задач. Однако подавляющее большинство FPIA основано на использовании антител [5].Для аптамеров увеличение массы в результате образования комплекса аналит-рецептор намного меньше, что снижает чувствительность анализа. Для повышения чувствительности анализа аптамеров FP недавно было предложено включение аптамеров в комплексы с белками, так называемые якорные модули. Использование комплексов биотинилированного аптамера с SA и конъюгата SA-IgG показало, что этот подход значительно снижает LoD. До недавнего времени был реализован FP-анализ, основанный на включении аптамеров в белковые комплексы, на примере АТФ-связывающего аптамера.Якорные модули также использовались в тесте FP на пиретроидные инсектициды с использованием нанотел. Однако белковые конъюгаты нельзя считать оптимальными из-за изменчивости их стехиометрии и риска агрегации. Самый простой вариант улучшения анализа FP основан на способности SSB связывать флуоресцентно меченый аптамер только в его свободном, неструктурированном состоянии. Присутствие целевого аналита и его взаимодействие с аптамером приводит к высвобождению рецептора с поверхности белка из-за структурирования FNA.Это взаимодействие значительно снижает уровень FP из-за уменьшения массы (~ 70 кДа), а также возможного увеличения сегментарного движения индикатора в форме лиганда. Минимальные эффекты тушения и рассеяния по сравнению с нековалентными наноматериалами повышают аналитическую точность [117]. Подобная модель может быть реализована с использованием моста биотин – SA (~ 60 кДа) или комплекса SA-IgG (~ 200 кДа). Вместо комплементарной цепи можно использовать флуоресцентный аналог [42]. Более сложным является механизм передачи сигнала для обнаружения тромбина.Эта система содержит комплекс флуорофор-аптамер, состоящий из двух связанных рецепторных единиц, одна из которых специфична для низкомолекулярного антигена, а другая нацелена на тромбин. Нить, частично комплементарная двум одиночным последовательностям, денатурирует всю структуру ДНК. В присутствии аналита конформационная перестройка низкомолекулярного аптамера вызывает диссоциацию комплекса, который становится свободным для дальнейшего комплексообразования с белком. Это приводит к двойному механизму связывания, первый из которых выявляет присутствие цели, а второй потенциально улучшает изменение массы зонда.Однако достигается лишь небольшое увеличение FP из-за относительно ограниченного размера белка и из-за некоторых эффектов локального движения флуорофора. Наконец, ответ FA может быть усилен путем введения в анализ масс-амплификации на основе SA [46]. В целом, по сравнению с усилением наноматериала, тестовый отклик и LoD (в лучшем случае нМ) улучшаются в меньшей степени. Еще одним ограничением использования белков-энхансеров в анализе FP является их вариативность от партии к партии и от поставщика к поставщику, а также необходимость работы в строго фиксированных условиях, согласующихся со свойствами и стабильностью биомолекул.Ли и Чжао [115] описали анализ с переключением структуры аптамера для молекул с низким весом с использованием SA в качестве усилителя сигнала. Молекула СК способствует образованию тесного контакта, уменьшая скорость вращения флуорофора. В этой конструкции кДНК, ковалентно связанная с SA, гибридизуется с FAM-меченным аптамером, приближая FAM к SA и обеспечивая гораздо более высокое значение FP из-за ограниченного вращения FAM. Связывание комплекса с низкомолекулярным антигеном и аптамером вызывает сдвиг SA-меченной кДНК и значительное снижение FР.Основным явлением является близость SA к FAM в дуплексном режиме, что позволяет значительно изменять FA при обнаружении цели. Метод позволяет обнаруживать 60 пМ AFB1, 1 нМ ОТА и 0,5 мкМ АТФ. Ma et al. [124] описали аптасенсор FP на основе ПЦР и SA как двойные усилители FP для обнаружения остатков хлорамфеникола в пище. Аптамер без метки взаимодействовал с аналитом, и полученный комплекс использовали в качестве матрицы для ПЦР. Затем добавляли прямой праймер, меченный FAM, и обратный праймер, меченный биотином, для амплификации матрицы и праймер, меченный FAM.Молекулярная масса праймера, меченного FAM, и соответствующего FP быстро увеличивалась. После добавления СК к смеси биотинсодержащие препараты образовывали большой комплекс по размеру и массе, что приводило к гораздо более высокой молекулярной массе. В оптимальных условиях был достигнут широкий линейный диапазон обнаружения 0,001–200 нМ. Li et al. [47] предложили увеличить размер и массу анализируемого комплекса для детекции микроРНК на основе FP. Предлагаемый метод может быть использован для обнаружения мишеней в лизатах опухолевых клеток без утомительной предварительной обработки и с линейностью в диапазоне от 10 пМ до 0.5 нМ с LoD до 3,4 пМ. Лю и др. [125] предложили использовать двумерный нанолист ДНК (DNS) для амплификации FP. Эта структура ДНК вызывает тушение флуоресценции. Меченая флуорофором рецепторная ДНК иммобилизуется на поверхности DNS путем гибридизации с ручкой ДНК (hDNA). Такой способ образования связи способствует значительному увеличению FP. После добавления аналита рецепторная ДНК из-за высокого сродства между гДНК и аналитом высвобождается с поверхности DNS, тем самым уменьшая FР.Определенное соединение было зарегистрировано со значительно сниженным значением FA. Достигнутый линейный диапазон составлял 10-50 нМ, а LoD составлял 8 нМ для обнаружения одноцепочечной ДНК. Отдельно стоит отметить повышение чувствительности FPIA от использования ферментов. Предложено использование каталитических рециркуляционных систем на основе ферментативных каскадов. Эти схемы реакций показали свою эффективность в сложных многопараметрических системах. Последнее поколение методов амплификации PFIA основано именно на комбинированном эффекте увеличения веса и рециркуляции аналитов на основе ферментов.Подходы, разработанные на основе этого принципа, можно классифицировать по участвующим ферментативным реакциям. Chen et al. [126] предложили анализ, в котором в присутствии малых молекул-мишеней ДНК 1, меченная FAM, и ДНК 2, меченная биотином, лигировали для получения интегрированной ДНК. Этот метод может обнаруживать 0,05–1 мкМ АТФ с 41 нМ LoD и обнаруживать 0,01–1 мкМ NAD ⁺ с 6,7 нМ LoD.

13. Общая оценка и валидация анализов на основе FP

Валидация — ключевой вопрос в системе обеспечения качества количественных анализов, подтверждающих соответствие предложенного анализа требованиям для его конкретного применения.Полученные результаты указывают на перспективность новой методики анализа и ее место среди альтернативных. В связи с этим следует охарактеризовать общие свойства тестов, основанных на использовании ФП в качестве регистрируемого сигнала, а также данные об их детальной валидации. Поскольку большинство новых форматов анализа, описанных выше, находятся на стадии лабораторной разработки прототипов аналитических систем, большая часть работ по валидации относится к вариантам FPIA. Однако они демонстрируют ряд свойств, общих для всех рассмотренных в обзоре методов.

Особенностью ФП и ФА является то, что они являются безразмерными параметрами, отражающими соотношение концентраций реагентов в реакционной среде. Благодаря этому результаты анализа характеризуются высокой воспроизводимостью и не зависят от особенностей тестирования в разных лабораториях (температурный режим, примеси в реакционной среде и т. Д.). Быстрое протекание реакций в растворе при отсутствии диффузионных препятствий позволяет регистрировать результаты анализа в равновесном режиме и тем самым исключать влияние колебаний времени записи на воспроизводимость и точность измерений.

В результате точность измерений в первую очередь определяется точностью дозирования реагентов и зависит от общего объема реакционной смеси. При анализе в кюветах для устройств FPIA от Abbott или других производителей (объем реакционной смеси 0,5–1 мл) относительное стандартное отклонение (RSD) обычно колеблется в пределах 5–7%. В случае микропланшетных фотометров с функцией регистрации поляризации флуоресценции (объем реакционной смеси в лунке микропланшета равен 0.1–0,2 мл) RSD может достигать 10%,

Точность определения концентрации аналита также зависит от калибровочной зависимости от концентрации, которая должна обеспечивать как низкие значения LoD, так и широкий диапазон между минимальным и максимальным зарегистрированными значениями поляризации. Таким образом, следует оптимизировать условия анализа (концентрации реагентов, состав реакционной среды и т. Д.). Основным критерием оценки эффективности предложенного протокола анализа является фактор Z ’, мера величины статистического эффекта, который рассчитывается по формуле (5) [127]:

Z ′ = 1−3 (σp + σn) (μp + μn)

(5)

где σ _p и σ _n — стандартное отклонение положительного и отрицательного контролей, соответственно, а μ _p и μ _n — значения FP положительного и отрицательного контролей, соответственно.Значение Z> 0,5 (его теоретический верхний предел равен 1) указывает на успешную оптимизацию. Например, Liu et al. [127] варьировали не только концентрации компонентов, но и расстояние между рабочим раствором и считывающим элементом. Такой подход позволил достичь Z ’0,7–0,8.

Используемые рецепторные молекулы (антитела, аптамеры и др.) Отвечают за специфичность FPA. В отличие от подтверждающих аналитических методов (хроматография, электрофорез и т. Д.), Анализы на основе рецепторов, включая рассматриваемые здесь FPA, генерируют один интегрированный сигнал для структурно схожих соединений, которые могут связываться с выбранным рецептором, поэтому списки перекрестно реагирующих соединений идентичны для различных Форматы анализов основаны на одних и тех же рецепторах, а значения перекрестной реактивности близки.

Часто утверждают, что FPA уступает по чувствительности таким методам, как ELISA [121]. Это результат прямой регистрации образования иммунных комплексов без усиления процессов. Однако для высокомолекулярных соединений, таких как антитела, была показана чувствительность FPA, сравнимая с ELISA [122]. Приведенная ниже оценка свойств FPA суммирована в таблице 2. В зависимости от тестируемых аналитов, FPA чаще всего сравнивают с ELISA как наиболее распространенным иммуноаналитическим методом и с различными хроматографическими методами в качестве типичных подтверждающих методов.По общему мнению, иммуноанализы должны обеспечивать лучшую корреляцию из-за использования одних и тех же рецепторных молекул. Фактически, R ² для иммуноанализов также может сильно отличаться, принимая во внимание разные принципы образования детектируемых комплексов и использование препаратов антител с разной аффинностью и специфичностью. Некоторые данные о корреляции с другими аналитическими методами собраны в Таблице 3.

14. Оборудование для FPA

В течение долгого времени потребность в специальном оборудовании ограничивала широкое распространение FPIA.Компания Abbott была одной из первых, кто создал полностью автоматизированный анализатор TDx, и долгое время оставался монополистом на рынке приборов FPIA и наборов реагентов. В настоящее время существует гораздо больше устройств для FPIA: Sentry (Ellie LLC, Germantown, WI, США), Beacon 2000 (PanVera, Madison, WI, США), Tecan Safire 2 (Tecan, Männedorf, Швейцария), Victor (LKB-Pharmacia , Брентвуд, Теннесси, США), Wallac Victor2V (Perkin Elmer, Биконсфилд, Великобритания) и другие. Кроме того, появились портативные детекторы FP производства Ellie LLC (Джермантаун, Висконсин, США) и BMG Labtech (Ортенберг, Германия).

Таким образом, Ellie LLC производит портативные детекторы для FPIA и совместимые наборы реагентов для диагностики здоровья животных, включая тесты на бруцеллез, туберкулез, прогестерон в молоке. Интересной особенностью их наборов является использование меченных флуоресцеином антигенных пептидов для обнаружения белковых антигенов по конкурентной схеме FPIA. В своих исследованиях Бородулева и соавт. использовали портативное устройство Ellie Sentry 200 для проведения анализов FP на различные контаминанты [109,135,136]. Три производных флуоресцеина сравнивали, чтобы гарантировать лучшую чувствительность анализа и минимальное потребление реагентов при определении тиабендазола и тетраконазола фунгицидов на основе FP [135].Наилучшие аналитические параметры были достигнуты при использовании 4-аминометилфлуоресцеина в качестве индикатора. ПД тиабендазола и тетраконазола в пшенице составляли 20 и 200 г / кг соответственно. На том же оборудовании определяли пестициды карбарил и триазофос в зернах пшеницы [109]. Метка, меченная производным флуоресцеина — тиокарбамил этилендиамина — применялась в FPIA. LoD для триазофоса и карбарила составляли 40 и 20 мг / кг соответственно. Портативный прибор Sentry 200 использовался в методике FPIA для определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в зернах злаков.Индикатор на основе 4-аминометилфлуоресцеина обеспечивает наивысшую чувствительность анализа, а именно 40 нг / г с аналитическим диапазоном 80–1000 нг / г [136]. Новые подходы к обнаружению результатов FPIA описаны в нескольких публикациях. Смартфоны можно использовать в составе сенсорных устройств после соответствующих надстроек. Таким образом, Zhao et al. [137] разработали сенсор для смартфона на основе камеры смартфона и компактного держателя, напечатанного на 3D-принтере. Чип сенсора в камере смартфона имеет две области, которые могут обнаруживать излучения с параллельной и перпендикулярной поляризацией.Специальное программное приложение может оценить среднюю интенсивность и степень поляризации. Конкурентный FPIA простагландина E2 продемонстрировал LoD 1,57 нг / мл. Wargocki et al. представляет собой простую портативную платформу для биологических анализов на базе сотового телефона, которую можно использовать с флуоресцентными анализами коллагеназы и трипсина с использованием флуоресцеина [138]. Система включает в себя бокс для считывания в темноте, камеру смартфона, планшет и поляризатор. Экран планшета выступает в роли источника возбуждения. Чувствительность анализа была сравнима с чувствительностью, полученной считывателем микропланшетов: а именно, наименьшее измеренное содержание в образце было 0.938 мкг и 930 пг для коллагеназы и трипсина соответственно. Разработанная сенсорная система была достаточно чувствительной для медицинской диагностики клинически значимых состояний в месте оказания медицинской помощи. Wakao et al. [139] сконструировали недорогой портативный анализатор FP с микроустройством для высокопроизводительных иммуноанализов FP на микотоксин ДОН. Анализатор смог одновременно обнаружить 96 образцов, требуя всего 1 нл в качестве объема образца. Авторы продемонстрировали, что разработанное устройство подходит для измерения на месте и тестирования в месте оказания медицинской помощи.Кроме того, авторы сообщили об успешной разработке быстрого обнаружения антител к вирусу птичьего гриппа подтипа H5 в сыворотке с помощью анализа FP с использованием того же портативного анализатора [140]. Анализ проводился в течение 20 мин, для его выполнения требовалось всего 2 мкл образца. Choi et al. [141] предложили микрожидкостный чип на основе капель для анализа активности дезоксирибонуклеазы (ДНКазы), не связанный с конъюгацией с красителями. Бромид этидия использовали в качестве реагента для интеркаляции ДНК и флуоресцентного репортера; следовательно, не требовалось предварительной конъюгации или модификации ДНК.Разработанная тест-система позволила определить полумаксимальную ингибирующую концентрацию этилендиаминтетрауксусной кислоты, при которой ингибирование активности ДНКазы 1 составило 1,56 ± 0,91 мМ. Schrell et al. [142] разработали систему для мониторинга инсулина в реальном времени, основанную на микрофлюидном онлайн-иммуноанализе ЖК. Он имеет LoD 4 нМ и подходит для использования в неспециализированных лабораториях. Цена на приборы для измерения поляризации флуоресценции неуклонно снижается. Многие устройства, такие как Spectromax M5 (Molecular Devices, Сан-Хосе, Калифорния, США), PolarStar Optima (BMG LabTechnologies, Ортенберг, Германия), Chameleon (Hidex, Турку, Финляндия) и Zenyth (Anthos Labtec Instruments, Вальс, Австрия) , обнаружение результатов FPIA в 96-луночных планшетах для ELISA, где FP измеряется после возбуждения / испускания вертикальным лучом.Для этого формата FPIA используются черные или белые планшеты, чтобы исключить помехи от соседних лунок. Такие пластины, как и обычные трубки, можно повторно использовать для производства FPIA. В последнее время 384-луночные планшеты также используются для FPIA, что значительно снижает расход реагентов (требуется всего несколько мкл) и увеличивает продуктивность определений. Использование считывающего устройства для микропланшетов Zenyth 3100 описано в серии статей [11,143,144]. Так, Зверева и соавт. использовали это оборудование для FPIA алкалоида колхицина (COL) и рактоманина (RAC) соответственно.Комбинация поликлонального антитела и антигена, меченного FITC, позволила выявить COL с LoD 1,8 нг / мл в течение 10 мин [143]. Для RAC оптимальные условия анализа позволили выявить 1 нг / мл также в течение 10 мин [144].

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

% PDF-1.4 % 1169 0 объект> эндобдж xref 1169 138 0000000016 00000 н. 0000003682 00000 н. 0000003056 00000 н. 0000003803 00000 н. 0000003840 00000 н. 0000004832 00000 н. 0000005003 00000 н. 0000005171 00000 н. 0000005340 00000 н. 0000005509 00000 н. 0000005681 00000 п. 0000005851 00000 п. 0000006022 00000 н. 0000006193 00000 п. 0000006364 00000 н. 0000006535 00000 н. 0000006706 00000 н. 0000006877 00000 н. 0000007049 00000 п. 0000007221 00000 н. 0000007393 00000 н. 0000007565 00000 н. 0000007735 00000 н. 0000007906 00000 н. 0000008077 00000 н. 0000008249 00000 н. 0000008421 00000 н. 0000008593 00000 н. 0000008765 00000 н. 0000008936 00000 н. 0000009108 00000 п. 0000009280 00000 н. 0000009451 00000 п. 0000009622 00000 н. 0000009793 00000 н. 0000009963 00000 н. 0000010133 00000 п. 0000010304 00000 п. 0000010475 00000 п. 0000010647 00000 п. 0000010819 00000 п. 0000010991 00000 п. 0000011163 00000 п. 0000011335 00000 п. 0000011506 00000 п. 0000011678 00000 п. 0000011850 00000 п. 0000012022 00000 п. 0000012194 00000 п. 0000012365 00000 н. 0000012537 00000 п. 0000012709 00000 п. 0000012881 00000 п. 0000013052 00000 п. 0000013224 00000 п. 0000013396 00000 п. 0000013568 00000 п. 0000013739 00000 п. 0000013910 00000 п. 0000014082 00000 п. 0000014253 00000 п. 0000014425 00000 п. 0000014593 00000 п. 0000014762 00000 п. 0000014931 00000 п. 0000015102 00000 п. 0000015273 00000 п. 0000015445 00000 п. 0000015616 00000 п. 0000015788 00000 п. 0000015960 00000 п. 0000016132 00000 п. 0000016304 00000 п. 0000016476 00000 п. 0000016648 00000 п. 0000016820 00000 н. 0000016992 00000 н. 0000017163 00000 п. 0000017334 00000 п. 0000017506 00000 п. 0000017678 00000 п. 0000017850 00000 п. 0000018022 00000 п. 0000018194 00000 п. 0000018366 00000 п. 0000018536 00000 п. 0000018707 00000 п. 0000018878 00000 п. 0000019050 00000 п. 0000019219 00000 п. 0000019388 00000 п. 0000019559 00000 п. 0000019730 00000 п. 0000019998 00000 п. 0000020397 00000 п. 0000020687 00000 п. 0000021143 00000 п. 0000021923 00000 п. 0000021974 00000 п. 0000022088 00000 п. 0000022429 00000 п. 0000022999 00000 н. 0000023262 00000 н. 0000023434 00000 п. 0000023801 00000 п. 0000024737 00000 п. 0000025579 00000 п. 0000026415 00000 п. 0000026678 00000 п. 0000027843 00000 п. 0000028164 00000 п. 0000028264 00000 п. 0000028758 00000 п. 0000029377 00000 п. 0000030092 00000 п. 0000030393 00000 п. 0000030811 00000 п. 0000031884 00000 п. 0000032049 00000 п. 0000032530 00000 п. 0000033161 00000 п. 0000037197 00000 п. 0000044786 00000 п. 0000046512 00000 п. 0000050783 00000 п. 0000051637 00000 п. 0000054910 00000 п. 0000055298 00000 п. 0000055447 00000 п. 0000055779 00000 п. 0000056967 00000 п. 0000057270 00000 п. 0000057335 00000 п. 0000057621 00000 п. 0000057994 00000 п. 0000058209 00000 п. 0000072289 00000 п. 0000096866 00000 п. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 1171 0 obj> поток xb«g`d`g`0gd @

Племенная культура, Мировая культура, Молодежная культура

Абстрактный

Термин «молодежная культура» обычно связан с идеями обновления, отказа от традиционных норм и ценностей, противодействия и восстания.Эта концепция проистекает из того факта, что в западных обществах «молодость» в первую очередь ассоциируется с конфликтами подросткового и полового созревания. Однако в случае с Нигериен Фульбе-Водаабе молодежь (суканааку) не рассматривается как этап личного развития, а скорее отождествляется с особыми компетенциями и социальной ответственностью. Здесь молодежь составляет важнейшую область культурного самовыражения и утверждения. Центральным институтом этой молодежной культуры являются мужские танцы, которые исполняются в контексте важных сезонных собраний.В последнее время эти танцы стали средством обмена с внешним миром. «Культ красоты» Водаабе привлекает фотографов, съемочные группы и туристов, а также представляет собой важный фактор для миграции в городские центры и в Европу. В качестве украшенных танцоров и фотографических объектов молодые мигранты Водаабе ощущают себя частью «мировой культуры». В статье акцентируется внимание на связи между формами культурного самоутверждения, которые сохраняются внутри этой группы кочевых скотоводов, и феноменами эклектического культурного потребления, апострофизируемого как «мировая культура».Mit dem Begriff «Jugendkultur» — это нормальная игра для Vorstellung von Erneuerung, von Bruch mit althergebrachten Normen und Werten, von Opposition und Rebellion verbunden. Diese Auffassung rührt daher, dass die, Jugend »в westlichen Gesellschaften в erster Linie mit Adoleszenz und pubertärem Konflikt assoziiert wird. Im Fall der nigrischen Fulbe-Wodaabe dagegen wird Jugend (sukanaaku) nicht in dieser Weise als bestimmte Phase der personalen Entwicklung Betrachtet, sondern mit besonderen Fähigkeiten und sozialen Pflichten identifiziert.Hier stellt die Jugend den wichtigsten Ort kultureller Selbstreflexion dar. Zentrale Institution dieser Jugendkultur sind die Tänze der jungen Männer, die im Rahmen der großen saisonalen Lineagetreffen aufgeführt werden. In jüngster Zeit wurden diese Tänze zu einem Medium des Austauschs mit der Außenwelt. Der «Schönheitskult» der Wodaabe zieht Fotografen, Kamerateams und Touristen и und spielt eine wichtige Rolle im Zusammenhang der Migrationen в городских Zentren und nach Europa. Также есть фотографии и объекты, которые можно найти в лесу Wodaabe-Migranten sich als Teil einer «Welt-Kultur».Der Artikel beschäftigt sich mit dem Problem der Verbindung zwischen Formen kultureller Selbstversicherung, die im Innern dieser Gruppe von nomadischen Rinderhaltern bewahrt werden, und als „Welt-Kultur” apostrophierten Erscheinktonschen des ekurlekungen.

Информация о журнале

Sociologus — всемирно известный рецензируемый журнал социальной антропологии. Он доступен в Интернете и в печатном виде и включен в основные научные указатели.Основанный в 1925 году Ричардом Турнвальдом, это один из самых известных антропологических журналов в немецкоязычном мире. Журнал посвящен эмпирическим исследованиям культурного разнообразия, социальных процессов и их трансформаций, а также контрастных форм социальных отношений. Он не имеет фиксированной тематической или региональной направленности, но занимается сравнительной интерпретацией и объяснением человеческого поведения. Его международный статус подчеркивается использованием английского в качестве второго языка публикации и тем фактом, что более половины подписок принадлежит зарубежным учреждениям.Сегодня Sociologus стремится предоставить европейским, особенно немецкоязычным, социальным антропологам возможность участвовать в международных дискуссиях и исследованиях посредством публикации, отвечающей самым высоким международным стандартам.

Информация об издателе

Издательство Duncker and Humblot в настоящее время издает более 250 научных монографий и антологий каждый год в более чем 150 сериях, а также 20 научных журналов и ежегодников.Программа включает более 15 000 доступных наименований в области права и экономики, экономики и социальных наук, истории, политологии, литературы, философии. Im Verlag Duncker и Humblot erscheinen derzeit jährlich über 250 wissenschaftliche Monographien bzw. Sammelbände in mehr als 150 Schriftenreihen sowie 20 wissenschaftliche Zeitschriften und Jahrbücher. Das Programm umfaßt mehr als 15 000 lieferbare Titel zu den Fachgebieten: Rechts- und Staatswissenschaften, Wirtschafts- und Sozialwissenschaften, Geschichte, Politikwissenschaft, Literaturwissenschaft, Philosophie.

Программа WCSS Middle.qxd — Международный союз почвоведов …

Стр. 2 и 3: 36 Расписания сессий по отделам SE

Стр. 4 и 5: Сессия. № Идентификатор симпозиума и

Стр. 6 и 7: Сессия. № Идентификатор симпозиума и

Стр. 8 и 9: СЕССИЯ № 1 Воскресенье, 9 июля 2006 г. SE

Стр. 10 и 11: СЕССИЯ № 4 Моделирование долгосрочного характера S

Стр. 12 и 13: СЕССИЯ № 11 11 -3 13:55 Европейский

Стр. 14 и 15: № СЕССИИ.15 dell’Ambiente и M

Стр. 16 и 17: СЕССИЯ № 19 Стефон Томас, Джером

Стр. 18 и 19: СЕССИЯ № 23 Арвинд Бхардвадж *, Радж

Стр. 20 и 21: СЕССИЯ № 30 СЕССИЯ № . 30 Конвен

Стр. 22 и 23: СЕССИЯ № 35 35-3 555b Scaling Env

Стр. 24 и 25: СЕССИЯ № 39 простой кислый сульфат So

Стр. 26 и 27: СЕССИЯ № 42 42-21 732a Песок L

Стр. 28 и 29: СЕССИЯ № 46 № СЕССИИ. 46 Конвен

Стр. 30 и 31: № СЕССИИ.51 lein * 1, Krisztian S

Стр. 32 и 33: СЕССИЯ № 56 56-5 639a A Сравнение

Стр. 34 и 35: СЕССИЯ № 61 № СЕССИИ. 61 Конвен

Стр. 36 и 37: СЕССИЯ № 66 Сельское хозяйство

Стр. 38 и 39: СЕССИЯ № 72 Дирсе К. Керн * 1, Джо

Стр. 40 и 41: СЕССИЯ № 77 СЕССИЯ №. 77 Конвен

Стр. 42 и 43: СЕССИЯ № 83 Луи Верху * 3 и

Стр. 44 и 45: СЕССИЯ № 88 СЕССИЯ № 89 Конвен

Стр. 46 и 47: № СЕССИИ.93 варианта. Kristian W

Стр. 48 и 49: СЕССИЯ № 98 98-3 11:05 Инфо

Стр. 104 СЕССИЯ № 104 Con

Стр. 52 и 53:

№ СЕССИИ. 107 107-7 439a Soil Cla

Стр. 54 и 55:

№ СЕССИИ. 112 112-5 17:00 Измерение

Стр. 56 и 57:

№ СЕССИИ. 115 Сайгуса 1, (1) Fiel

Стр. 58 и 59:

№ СЕССИИ. 116 Res, (3) USDA-ARS, (

Page 60 и 61:

SESSION NO.117 Южный бассейн и

Стр. 62 и 63:

№ СЕССИИ. 119 phic Feature Format

Стр. 64 и 65:

НОМЕР СЕССИИ. 122 122-16 345b Visuali

Стр. 66 и 67:

№ СЕССИИ. 126 Диксон 2, Отилио А.

Стр. 68 и 69:

№ СЕССИИ. 128 (2) Мой университет, (3) наб.

, стр. 70 и 71:

№ СЕССИИ. 132 Costantini 2, Enri

Стр. 72 и 73:

№ СЕССИИ. 135 135-5 557b Завод Up

Стр. 74 и 75:

№ СЕССИИ.136 Soracco 1, Guiller

Стр. 76 и 77:

№ СЕССИИ. 137 137-42 770b The Div

Стр. 78 и 79:

№ СЕССИИ. 138 Климат, Univ of Mi

Стр. 80 и 81:

№ СЕССИИ. 139 СЕССИЯ № 139 Con

Стр. 82 и 83:

№ СЕССИИ. 140 по почвоведению, (2

стр. 84 и 85:

СЕССИЯ № 142 142-2 854a Корневой Exu

стр. 86 и 87:

СЕССИЯ № 144 144-20 961b The Eff

стр 88 и 89:

СЕССИЯ №145 СЕССИЯ № 145 Con

Стр. 90 и 91:

№ СЕССИИ. 146 СЕССИЯ № 146 Con

Стр. 92 и 93:

№ СЕССИИ. 148 компоста в C

Page 94 и 95:

№ СЕССИИ. 150 Хамид Реза Рахмани *

Стр. 96 и 97:

№ СЕССИИ. 151 151-29 1345a Erodib

Стр.98 и 99:

№ СЕССИИ. 153 Гальегос, Сирило Ва

Стр. 100 и 101:

№ СЕССИИ. 154 Konuskan 1, Boujam

Стр. 102 и 103:

№ СЕССИИ.155 № СЕССИИ. 155 Con

Стр. 104 и 105:

№ СЕССИИ. 155 155-54 1714b Проба

Стр. 106 и 107:

№ СЕССИИ. 155 Minteguiaga 2, Hug

Стр. 108 и 109:

№ СЕССИИ. 155 155-162 1921b Micro

Стр. 110 и 111:

№ СЕССИИ. 158 158-2 1642b Polluti

Стр. 112 и 113:

№ СЕССИИ. 159 159-12 1747b Evalua

Стр. 114 и 115:

№ СЕССИИ. 161 Forbes Walker * 1,

Стр. 116 и 117:

№ СЕССИИ.163 163-7 2504a Dynamic

Стр. 118 и 119:

№ СЕССИИ. 164 164-15 1963a Экран

Стр. 120 и 121:

НОМЕР СЕССИИ. 166 langa G. Jezile * 1

Стр. 122 и 123:

№ СЕССИИ. 168 Харрис 3, A.K.M. S

Стр. 124 и 125:

№ СЕССИИ. 171 СЕССИЯ № 171 Con

Стр. 126 и 127:

№ СЕССИИ. 175 175-3 2911a Почва или

Стр. 128 и 129:

№ СЕССИИ. 177 Crobial Ecology, (2

Стр.130 и 131:

НОМЕР СЕССИИ.179 корреляция с th

Page 132 и 133:

Awiti, A., 160-8 Ayars, James, 153-

Page 134 и 135:

Chen, Zueng-Sang, 170-29, 85-8, 121

Page 136 и 137:

Feller, Christian, 38-2, 36-5, 54-1

Page 138 и 139:

Hegde, M., 150-16 Hegymegi, Peter,

Page 140 и 141:

Хосла, Раджив, 19-10, 147-15 Кхума

Стр. 142 и 143:

Маэ, Жан-Люк, 159-17 Магалхаес

Стр. 144 и 145:

Нельсон, Тиррелл, 94 -3 Nemes, Attila

Page 146 и 147:

Rangarajan, Anusuya, 156-11 Ranger,

Page 148 и 149:

Siddaramappa, R., 155-156, 154-1, 1

Стр. 150 и 151:

Цулуча, Ф., 151-32 Цугиюки, M

Стр. 152 и 153:

Зартман, Ричард, 145-35 Зартман, R

Страница 154:

188 ПРИМЕЧАНИЯ

% PDF-1.6 % 5814 0 объект > эндобдж xref 5814 253 0000000016 00000 н. 0000015801 00000 п. 0000015939 00000 п. 0000016209 00000 п. 0000016247 00000 п. 0000016810 00000 п. 0000016949 00000 п. 0000017260 00000 п. 0000017644 00000 п. 0000018029 00000 п. 0000018068 00000 п. 0000018107 00000 п. 0000018220 00000 п. 0000018335 00000 п. 0000041518 00000 п. 0000064069 00000 п. 0000087604 00000 п. 0000108934 00000 п. 0000131687 00000 н. 0000154114 00000 н. 0000176302 00000 н. 0000200410 00000 п. 0000591836 00000 н. 0000594487 00000 н. 0000597153 00000 п. 0000598177 00000 н. 0000602023 00000 н. 0000602273 00000 н. 0000602344 00000 п. 0000602694 00000 н. 0000602723 00000 н. 0000603201 00000 н. 0000609930 00000 н. 0000610205 00000 н. 0000610546 00000 н. 0000612034 00000 н. 0000612295 00000 н. 0000612672 00000 н. 0000614700 00000 н. 0000614979 00000 п. 0000615331 00000 н. 0000615406 00000 н. 0000615523 00000 п. 0000615604 00000 н. 0000615650 00000 н. 0000615780 00000 н. 0000615914 00000 н. 0000615959 00000 н. 0000616121 00000 н. 0000616226 00000 н. 0000616270 00000 н. 0000616393 00000 н. 0000616437 00000 н. 0000616581 00000 н. 0000616669 00000 н. 0000616713 00000 н. 0000616804 00000 н. 0000616848 00000 н. 0000616951 00000 п. 0000616995 00000 н. 0000617100 00000 п. 0000617144 00000 н. 0000617250 00000 н. 0000617294 00000 н. 0000617397 00000 н. 0000617441 00000 н. 0000617485 00000 н. 0000617613 00000 н. 0000617659 00000 н. 0000617789 00000 н. 0000617952 00000 н. 0000618080 00000 н. 0000618125 00000 н. 0000618255 00000 н. 0000618421 00000 н. 0000618534 00000 п. 0000618579 00000 н. 0000618727 00000 н. 0000618854 00000 п. 0000618899 00000 н. 0000619028 00000 н. 0000619169 00000 н. 0000619298 00000 п. 0000619343 00000 п. 0000619472 00000 н. 0000619631 00000 н. 0000619676 00000 н. 0000619822 00000 н. 0000619867 00000 н. 0000620021 00000 н. 0000620066 00000 н. 0000620221 00000 н. 0000620266 00000 н. 0000620311 00000 н. 0000620480 00000 н. 0000620525 00000 н. 0000620667 00000 н. 0000620712 00000 н. 0000620864 00000 н. 0000620909 00000 н. 0000621046 00000 н. 0000621091 00000 н. 0000621250 00000 н. 0000621295 00000 н. 0000621428 00000 н. 0000621473 00000 н. 0000621518 00000 н. 0000621741 00000 н. 0000621786 00000 н. 0000621968 00000 н. 0000622013 00000 н. 0000622058 00000 н. 0000622213 00000 н. 0000622258 00000 н. 0000622438 00000 н. 0000622483 00000 н. 0000622650 00000 н. 0000622695 00000 п. 0000622858 00000 п. 0000622903 00000 н. 0000622948 00000 н. 0000623147 00000 п. 0000623192 00000 п. 0000623341 00000 п. 0000623386 00000 н. 0000623544 00000 н. 0000623589 00000 н. 0000623634 00000 п. 0000623781 00000 п. 0000623827 00000 н. 0000623989 00000 п. 0000624035 00000 н. 0000624227 00000 н. 0000624273 00000 н. 0000624462 00000 н. 0000624508 00000 н. 0000624666 00000 н. 0000624712 00000 н. 0000624884 00000 н. 0000624930 00000 н. 0000625073 00000 н. 0000625119 00000 н. 0000625255 00000 н. 0000625301 00000 п. 0000625486 00000 н. 0000625532 00000 н. 0000625711 00000 н. 0000625757 00000 н. 0000625988 00000 н. 0000626034 00000 н. 0000626276 00000 н. 0000626322 00000 н. 0000626529 00000 н. 0000626575 00000 н. 0000626789 00000 н. 0000626835 00000 н. 0000626999 00000 н. 0000627045 00000 н. 0000627228 00000 н. 0000627274 00000 н. 0000627449 00000 н. 0000627495 00000 н. 0000627541 00000 н. 0000627734 00000 н. 0000627779 00000 н. 0000627991 00000 н. 0000628037 00000 н. 0000628172 00000 н. 0000628218 00000 н. 0000628389 00000 п. 0000628435 00000 п. 0000628580 00000 н. 0000628626 00000 н. 0000628781 00000 п. 0000628827 00000 н. 0000628994 00000 н. 0000629040 00000 н. 0000629175 00000 н. 0000629221 00000 н. 0000629432 00000 н. 0000629478 00000 н. 0000629607 00000 н. 0000629653 00000 н. 0000629812 00000 н. 0000629858 00000 н. 0000630059 00000 н. 0000630105 00000 п. 0000630263 00000 н. 0000630309 00000 н. 0000630496 00000 п. 0000630541 00000 п. 0000630724 00000 н. 0000630769 00000 н. 0000630953 00000 п. 0000630998 00000 н. 0000631043 00000 н. 0000631217 00000 н. 0000631263 00000 н. 0000631445 00000 н. 0000631491 00000 н. 0000631671 00000 н. 0000631717 00000 н. 0000631841 00000 н. 0000631887 00000 н. 0000631933 00000 н. 0000632024 00000 н. 0000632070 00000 н. 0000632191 00000 п. 0000632237 00000 н. 0000632397 00000 н. 0000632443 00000 н. 0000632625 00000 н. 0000632671 00000 н. 0000632880 00000 н. 0000632926 00000 н. 0000633104 00000 п. 0000633150 00000 н. 0000633397 00000 н. 0000633443 00000 н. 0000633665 00000 н. 0000633711 00000 п. 0000633884 00000 п. 0000633930 00000 н. 0000634074 00000 н. 0000634120 00000 н. 0000634312 00000 н. 0000634358 00000 п. 0000634517 00000 н. 0000634563 00000 н. 0000634744 00000 н. 0000634790 00000 н. 0000634836 00000 н. 0000634963 00000 н. 0000635008 00000 н. 0000635138 00000 п. 0000635372 00000 п. 0000635417 00000 п. 0000635600 00000 н. 0000635645 00000 н. 0000635690 00000 н. 0000635870 00000 н. 0000635915 00000 н. 0000636060 00000 н. 0000636105 00000 п. 0000636234 00000 п. 0000636279 00000 н. 0000636452 00000 п. 0000636497 00000 н. 0000636645 00000 н. 0000636690 00000 н. 0000636735 00000 н. 0000015572 00000 п. 0000005489 00000 н. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 6066 0 объект > поток N {ٗ 0 N

(PDF) Хорошо поесть, хорошо жить с: кочевники и животные Северной Евразии и Африки | Флориан Стаммлер

(PDF) Хорошо поесть, с чем приятно жить: Кочевники и животные Северной Евразии и Африки | Флориан Стаммлер — Academia.edu

Academia.edu больше не поддерживает Internet Explorer.

Для более быстрого и безопасного просмотра Academia.edu и всего Интернета, пожалуйста, обновите свой браузер за несколько секунд.

Войти с Facebook
Войти с Google

Зарегистрироваться с Apple

Загрузить PDFЗагрузить полный пакет PDFКраткое содержание этой статьи37 Полные PDF-файлы, относящиеся к этой статьеЧитать доклад

Загрузка предварительного просмотра

К сожалению, предварительный просмотр в настоящее время недоступен.Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

Загрузка предварительного просмотра

Извините, предварительный просмотр в настоящее время недоступен. Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

Загрузка предварительного просмотра

Извините, предварительный просмотр в настоящее время недоступен. Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

Загрузка предварительного просмотра

Извините, предварительный просмотр в настоящее время недоступен. Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

Загрузка предварительного просмотра

Извините, предварительный просмотр в настоящее время недоступен.Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

Загрузка предварительного просмотра

Извините, предварительный просмотр в настоящее время недоступен. Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

Загрузка предварительного просмотра

Извините, предварительный просмотр в настоящее время недоступен. Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

Загрузка предварительного просмотра

Извините, предварительный просмотр в настоящее время недоступен. Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

Загрузка предварительного просмотра

Извините, предварительный просмотр в настоящее время недоступен.Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

Загрузка предварительного просмотра

Извините, предварительный просмотр в настоящее время недоступен. Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

Загрузка предварительного просмотра

Извините, предварительный просмотр в настоящее время недоступен. Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

Загрузка предварительного просмотра

Извините, предварительный просмотр в настоящее время недоступен. Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

Загрузка предварительного просмотра

Извините, предварительный просмотр в настоящее время недоступен.Вы можете скачать статью, нажав кнопку выше.

.